Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии - Хеншен А.
ISBN 5-03-001337-7
Скачать (прямая ссылка):
проводили на колонке с сильным анионообменником. Элюеитом служила смесь
3%-ной метафосфориой и 8%-ной уксусной кислот. Это исследование [132]
демонстрирует преимущество использования специфических и чувствительных
детекторов для обнаружения индивидуальных соединений, входящих в состав
сложных природных смесей.
Электрохимические детекторы были также применены [133] для обнаружения
аскорбиновой кислоты в морских животных; хроматографическое разделение
было осуществлено на колонке с анионообменником. Интересный подход описан
в работе [88], авторы которой заменили органические ион-парные соединения
неорганическими ионами в высокой концентрации. Разделение
Витамины 60J
Рис. 12.13. Разделение методом анионообменной хро матографии мочевой (1)
и аскорбиновой (2) кислот, содержащихся в моче человека [132].
Колонка: 500X2,1 мм, стеклянная; неподвижная фаза: зипакс SAX; элюент: 50
мМ ацетатный буфер, pH 4,75; температура: 25 °С; объемная скорость: 0,33
мл/мин; обнаружение: электрохимический детектор, потенциал 700 мВ
относительно AgjAgCl; проба: разбавленная в соотношении 1 : 10G
проба мочн, содержащая 19 иг аскорбиновой кислоты.
t, МИН
проводилось на колонке, заполненной силикагелем с привитыми
октадецильными группами; аскорбиновая кислота, ниацин, пи-ридоксин,
ниацинамид и тиамин элюировались 0,5 мМ раствором сульфата лития в смеси
вода/метанол (95:5).
12.2.5. Никотиновая кислота
Данные о разделении никотиновой кислоты и ее амида приведены в ряде
публикаций, посвященных групповому разделению водорастворимых витаминов,
о которых уже говорилось в данной главе [84-86, 88, 101]. Однако
применение ВЭЖХ для определения этих веществ в биологических материалах -
пище, биологических жидкостях или тканях - рассмотрено лишь в считанных
работах. К сожалению, для хроматографических ме-
О
п
Рис. 12.14. Структура никотиновой кислоты и никотинамида.
¦606 Глава 12
тодов в данном случае характерна низкая чувствительность (так, например,
концентрация никотиновой кислоты в пищевых продуктах должна превышать 10
мг/л) [134]. В ряде ситуаций поэтому применяют менее селективные, но
более чувствительные методы анализа, например ГЖХ [135-137].
12.2.6. Фолиевая кислота
К природным производным фолиевой кислоты относится семейство соединений,
отличающихся по степени окисления птериди-новного кольца, по числу
остатков глутамата и по состоянию заместителя с одним углеродным атомом в
положении N-5 или N-10.
Рис. 12.15. Структура фолиевой кислоты.
Традиционно полиглутаминовые производные анализируют после их
предварительного гидролиза до соответствующих мо-ноглутаматов методом
ионообменной хроматографии на неподвижных фазах на основе целлюлозы.
Метод трудоемок, отличается низкой чувствительностью и плохой
воспроизводимостью. Именно эти причины и стимулировали разработку ряда
методов ВЭЖХ (табл. 12.11).
12.3. Исследование витаминов в биологических объектах
Задача хроматографического разделения стандартных смесей большинства
витаминов была решена в начале 70-х годов, однако разделение витаминов и
их производных, содержащихся в биологических пробах, до сих пор
представляет собой одну из сложнейших задач аналитической химии и
биохимии. Для решения этой задачи можно использовать три основных
подхода. На стадии подготовки пробы из нее удаляют основную массу
органических и неорганических компонентов и повышают концентрацию
витаминов настолько, чтобы она соответствовала пределу их обнаружения.
Классические методы подготовки образцов- экстракция и упаривание-не
только трудоемки, но и отличаются плохой воспроизводимостью (последний
недостаток можно исправить путем введения внутренних стандартов). Кроме
того, в результате воздействия тепла или света в пробе мо-
t
3
Витамины 607
Рис. 12.16. Разделение методом ион-парной хроматографии трех форм
фолиевой кислоты'с различной степенью окисления и N-(n-амино-бензоил)-L-
глутаминовой кислоты [140].
Колонка: 300X4 мм; неподвижная фаза: jx-бондапак С18 (10 мкм); элюент:
35%-ный раствор метанола в воде и 5 мМ. тетрабутнламмонийфосфаг; объемная
скорость: 1 мл/мнн, температура: комнатная; обнаружение: УФ-детектор, 254
нм.
1 •- меркаптоэтанол; 2 - 5,6,7,8-тетрагидрофолневая кислота; содержащая
примесн; 3 - ЛМя-амннобензо-ил)-Ь-глутаминовая кислота; 4 - 5,6,7,7-
тетрагндрофо-лневая кислота; 5 - 7,8-днгндрофолиевая кислота; 6 -
фолиевая кислота.
гут протекать нежелательные реакции, например фотоизомеризация ретиналей
[15] или окисление аскорбиновой кислоты [130], и на хроматограмме будут
появляться ложные пики.
Избежать нежелательных превращений витаминов можно, пользуясь двумя
следующими подходами. Во-первых, удалить из пробы высокомолекулярные
соединения (например, белки) и соли можно при помощи гель-проникающей
хроматографии [3, 4, 47]. Во-вторых, очистка и концентрирование проб
могут проводиться при помощи предколонок непосредственно в процессе
