Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
или разламываться, то фиксирующий раствор должен быть гипертоническим.
Время фиксации в первом случае обычно может быть достаточно коротким, но
во втором случае оно должно быть достаточно продолжительным, чтобы
фиксатор мог проникнуть в центр образца. Более продолжительные вре-
Препарирование биологических объектов для РЭМ
229
мена фиксации обладают дополнительным преимуществом, заключающемся в
упрочнении ткани, что несколько облегчает изготовление излома на
последней стадии препарирования.
Другими факторами, которые должны учитываться при составлении
фиксирующего раствора, являются pH, компенсирующие ионы и температура.
Первые два фактора должны быть насколько можно ближе к исходным
жидкостям, окружающим клетку и ткань. Фиксирование ткани млекопитающих
обычно производится при температуре около 277 К. Необходимо также
соблюдать осторожность при выборе буфера, так как важно, чтобы он был
достаточно эффективным в диапазоне pH образца. Имеется несколько путей
проведения фиксации: образец может выдерживаться в паровой фазе
фиксатора, погружаться или плавать на поверхности в фиксирующем растворе,
а в случае больших животных опрыскиваться in vivo фиксирующим раствором.
Фиксация в парах используется для сохранения хрупких воздушных структур,
в то время как фиксация с помощью погружения и опрыскивания дает гарантию
того, что фиксатор достигнет соответствующих частей образца настолько
быстро, насколько это возможно, фиксация при плавании на поверхности
оказывается эффективной для листьев, лепестков и кожи.
Несмотря на то что имеется целый ряд химикатов, которые могут быть
использованы в качестве фиксаторов для биологических объектов [331 ],
обычно полагают, что для большинства тканей пригодной была бы двойная
фиксация в органическом альдегиде и далее в четырехокиси осмия (оба в
идентичных фиксирующих растворах). Наиболее часто используемым альдегидом
является глютаральдегид (2-5%), но он должен быть смешан с 1-2%-ным
формальдегидом и/или акролеином, который проникает в ткани быстрее, чем
диальдегид. Такая комбинация, в частности, является полезной для
сохранения растительных тканей. При использовании акролеина необходимо
предпринимать меры предосторожности, так как он представляет собой
летучую, легко воспламеняющуюся и токсическую жидкость. Конечная
концентрация фиксирующего химиката диктуется образцом и составом
фиксирующего раствора, но редко превышает 5% по отношению ко всему
фиксирующему раствору. Большинство тканей удобно фиксировать в течение
ночи при комнатной температуре, и в течение этого времени полезно
поддерживать фиксирующий раствор перемешанным.
После первоначальной фиксации ткань должна быть промыта в изотоническом
буферном растворе и окончательно отфикси-рована в течение 4 ч в 1-2%-ном
растворе четырехокиси осмия при той же температуре, при которой
производилась фиксация в альдегиде. Образцы должны быть хорошо отмыты от
избыточ-
230
Глава 11
ного осмия и быстро прополоснуты в буферном растворе. Большинство тканей
фиксируется погружением, либо помещением извлеченного из ткани небольшого
кусочка в большой объем фиксатора, либо непрерывной промывкой образца in
situ в большом объеме фиксатора с последующим его иссечением и
погружением в фиксатор. Альтернативный способ опрыскивания лучше всего
пригоден для тканей млекопитающих, и подробности этой методики описаны в
книге [331]. Для хрупких образцов описан обменный метод препарирования
[332], исключающий полностью повреждение образца за счет предотвращения
внезапных изменений концентрации и состава.
Считается, что криофиксация является весьма важной методикой
препарирования для РЭМ. Ткань стабилизируется путем быстрого
замораживания и разрезается или разламывается в замороженном состоянии.
Полученные таким образом материалы исследуются и анализируются либо
высушенными в замороженном состоянии, либо замороженными в
гидратированном состоянии. Такие методики, в частности, полезны при
препарировании материалов для рентгеновского микроанализа ионов и
электролитов, и дальнейшие подробности представлены в главе по
препарированию образцов для микроанализа (гл. 12). Криофиксация и
исследование тканей, замороженных в гидратированном состоянии, также
являются потенциально полезными для изучения трехфазных систем газ -
жидкость - твердое тело, какими являются легочная ткань, воздушная пена и
продукты брожения хлебопекарной промышленности, или та-ких веществ, как
масла, жиры, смазки, которые являются летучими при обычной температуре.
Препарирование .таких объектов обычными методами приводит к полному
удалению клеточных жидкостей, из-за чего невозможно провести различие
между спорными структурами газовой и жидкой фаз. Обзор методов, включая и
некоторые применения к биологическим материалам, дается в недавно
изданной книге [333]. Следует, однако, понимать, что для большинства
морфологических исследований криофиксация не является лучшим способом
