Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
номером, коэффициент отражения электронов для которых достаточно мал, и
поэтому, для того чтобы увели-
240
Глава 11
Гг
* х г 'ZL
. \>*Ут
1
ЯЯ
' j?-.. %•> 1'
A4b*V4--> < к->?А>г ¦ • •• •
¦ ^^иад
Рис. II.14. Изображение в РЭМ исходной поверхности излома зуба человека с
металлической пломбой; метка составляет 2 мкм (а), и изображение в РЭМ
ацетатной ленты и реплики на силиконовой резине поверхности излома зуба
человека с металлической пломбой (б) [345].
Препарирование биологических объектов для РЭМ
241
Рис. 11.15. Реплика разветвленной капиллярной сети собаки, полученная
введением латекса [346].
чить сигнал, необходимо вводить по возможности более тяжелые элементы.
Обычно это достигается добавлением смеси таких элементов, как серебро,
осмий, свинец, уран и золото, которые являются умеренно специфичными для
определенных биологических структур, когда они применяются либо для
окрашивания блоков, либо к срезам тканей. В работах [351, 352] дается
обзор методов получения изображения биологических объектов в режиме
отраженных электронов и приведены ссылки на рецепты для специальных
красителей. Окрашивание повышает как коэффициент вторичной электронной
эмиссии, так и коэффициент отражения. Одна из проблем, связанная с этим
методом, состоит в необходимости отличать топографический контраст от
контраста, зависящего от атомного номера, а также в устранении ярких
областей, обусловленных зарядкой. Сложностей, связанных с топографическим
контрастом, можно до некоторой степени избежать, изучая либо срезы
тканей, либо плоские поверхности массивных образцов. Контраст образцов,
зависящий от атомного номера, из-за окрашивания усиливается за счет
топографического контраста, что делает более затруднительной однозначную
идентификацию морфологических особенностей в клетках и тканях.
242
Глава 11
Рис, 11.16. Изображение во вторичных электронах (а) и в отраженных
электронах (б) культуры клеток ткани Хела, окрашенных серебряным
красителем Вильдера. (Углеродное покрытие.) Маркер составляет 10 мкм
[353].
Рис, 11.17. Пример применения специфических гистологических методик. о -
изображение в ПЭМ костного мозга контрольной крысы, окрашенного осьмиевым
красителем DAB без эндогенной активности к перокепдазе: и - изображение в
ПЭМ костного мозга крысы, содержащего краситель, обладающий активностью к
перокепдазе, и окрашенного осьмиевым красителем DAB дтн перокендлзы: в -
изображение костного мозга крысы, содержащего оеьмневый краситель DAB.
обладающий активностью к перок-сидазе, полученное во вторичных
электронах: г - изображение образца, показанного на рис. в в отраженных
электронах [356].
Препарирование биологических объектов для РЭМ
Рис. 11.18. Красные кровяные тельца человека, меченные T4-ig'G; ясно
видны части головы и хвоста фага (а), и красные кровяные тельца человека,
меченные T4-lgG в смеси с красными кровяными тельцами человека и цыпленка
(б) [365].
*
Рис. 11.19. Красные кровяные тельца человека, контрольный эксперимент в
присутствии ингибитора для защиты от адсорбирования гранул золота
поверхностью (а), и красные кровяные тельца человека, маркированные
гранулами золота и меченные агглютинином соевых бобов и агглютинином
семени пшеницы (б) [362].
Есть много способов применения красителей. В работах [352, 353], как
показано на рис. 11.16, окрашивание тканей производилось непосредственно
аммиачным серебром Уилдера и метанамидом серебра Гомори, каждый из
которых обладает сродством к ядрам и сетке нервных волокон. В работе
[354] для окрашивания тканей млекопитающих использовался нитрат серебра,
а в неопубликованной работе Эчлина в качестве неспецифического красителя
для исследуемого в РЭМ растительного материала использовался краситель в
виде насыщенного водного раствора уранилацетата. В работе ;[355]
описываются три методики окрашивания тканей солями урана, свинца, серебра
и вольфрама. В противоположность этому можно, как показано в [356] (рис.
11.17), применять более специфические гистохимические методики, в которых
конечный продукт энзимной
244
Глава 11
или биохимической реакции выпадает в осадок в виде тяжелого металла,
такого, как соли свинца, урана или висмута. Большинство окрашивающих и
гистохимических методов, которые используются в РЭМ, является
модификацией методов, используемых в оптической и просвечивающей
электронной микроскопии, и читателю рекомендуется просмотреть эти
источники для выявления методик, которые можно приспособить для растровой
электронной микроскопии. Метод авторадиографии может быть использован для
локализации областей со специфической физиологической активностью, в то
время как проявленные зерна серебра можно отобразить в режиме отраженных
электронов. В работе [357] при изучении клеточного цикла культуры тканей
с успехом использовались в совокупности оптический микроскоп, метод
авторадиографии и РЭМ. Обзор этих методов представлен в работе [358],
Один метод локализации со специфической физиологической активностью был
