Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
препарирования, и здесь лучше использовать более распространенные методы.
Необходимо подчеркнуть, что каждый образец уникален сам по себе и требует
своего специфического способа фиксации. Важно экспериментировать,
производя фиксацию новой ткани, изменяя размер образца, время и
температуру фиксации, тип, концентрацию и pH конечного фиксатора и
сопоставлять с наблюдениями в оптическом микроскопе и ПЭМ. Наконец,
необходимо помнить, что стабилизация ткани является одним из многих
различных процессов препарирования тканей, которую лучше производить в
непрерывной последовательности событий. Важно, чтобы за фиксацией
следовало либо обезвожива-
Препарирование биологических объектов для РЭМ
231
ние, либо окрашивание с последующим обезвоживанием. Процесс может быть
временно приостановлен либо когда образец находится в 70%-ном этаноле,
либо когда образец полностью обезвожен и перед нанесением покрытия
хранится в эксикаторе.
Как только фиксация завершена, для дальнейшей обработки образца имеется
много различных возможностей. Можно сразу начать обезвоживание,
попытаться выявить внутренние части образца или попытаться локализовать
области со специфическими физиологическими функциями.
11-.3.5. Вскрытие внутренних поверхностей
Одним из удивительных свойств биологического материала является наличие
очень большой площади внутренней функциональной поверхности. Был
разработан ряд методик, позволяющих изучать эти внутренние поверхности:
нарезка, когда происходит направленная обработка затвердевшего образца с
помощью широких ножей; излом, при котором образец разламывается
предположительно вдоль поверхности структурной непрерывности, но часто в
некоторой случайной точке с выявлением двух сильно изрезанных
поверхностей; получение реплик, когда изготавливается пластиковый слепок
с исследуемой структуры, выявляемой после того, как биологический
материал удаляется химическим растворением.
Внутреннее содержимое может быть обнаружено в большей или меньшей степени
на любой стадии процесса препарирования даже в микроскопе с помощью
микродиссекции. Однако большинство биологических тканей являются очень
мягкими, и более общепринято получение срезов и изломов после
стабилизации и обезвоживания.
11.3.5.1. Получение срезов
Срезы тканей могут быть изготовлены с помощью стандартных методик,
используемых в обычной оптической и просвечивающей электронной
микроскопии, и рассмотрены в РЭМ либо в режиме на просвет, либо на
отражение. Одно из преимуществ РЭМ состоит в том, что в просвечивающем
режиме в нем при данном ускоряющем напряжении можно исследовать срезы в
20 раз большей толщины, хотя и с несколько худшим разрешением. На срезах,
исследованных в режиме на отражение, обнаруживается больше деталей, если
перед исследованием удаляется заливочная среда и обнажается биологический
материал. В случае тонких срезов (20-200 нм) материал подвергается
фиксации, обезвоживанию и заливке в одну из эпоксидных
232
Глава 11
Рис. 11.7. Микрофотография в растровом электронном микроскопе среза
толшиной 1 мкм свернутой трубочки почки мыши, залитого смесью аралдита и
эпона [336].
Поверхность срезл подвергалась травлению в кислородной плазме, оттенялась
сплавом платина-палладий и затем на нее распылялось золото.
Внутриклеточные структуры идентифицировались по резистентным к травлению
остаткам, образующим структуры на поверхности среза после травления. На
поверхностях клеток, выстилающих полость трубочки (L), между соседними
клетками и в правом верхнем углу микрофотографии, охватывающими базальную
ламину, видны мембраны плазмы (Р); /V -ядра; М - митохондрии; MQ -
гранулы митохондриального матрикса.
смол. Срезы нарезаются на ультрамикротоме, а смола удаляется с помощью
органических растворителей, метилата натрия и с помощью контролируемого
стравливания ионным пучком или в низкотемпературной плазме газового
разряда .[334]. С другой стороны, тонкие срезы могут быть непосредственно
смонтированы на твердой подложке и исследованы в РЭМ без дальнейшей
обработки. На кажущихся плоскими срезах, в особенности на срезах,
высушенных в замороженном состоянии, может быть обнаружено значительное
количество деталей.
Более толстые срезы (0,2-5,0 мкм) могут быть также вырезаны из залитого в
смолу материала, а смола может быть удалена с помощью методики, описанной
в работе [335]. Срезы толщиной от 2 до 10 мкм могут быть вырезаны из
залитых смо-
Препарирование биологических объектов для РЭМ
233
лой или твердым парафином материалов на обычных микротомах, парафин затем
может быть удален с помощью ксилола, а смола - с помощью вышеупомянутых
методов. Срезы либо укрепляются на маленьких покровных стеклах с помощью
клея Хаупта для проведения сравнительных исследований в оптическом
микроскопе и РЭМ или они вылавливаются на прозрачные для электронов
подложки для проведения сравнительных исследований в РЭМ/ПЭМ.
В работе [336] использовалась кислородная плазма для травления
