Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
позаимствован нз ПЭМ. Этот метод меток поверхности клетки, который,
будучи применен к образцам для РЭМ, приводит к образованию на поверхности
клетки морфологически различаемых или аналитически идентифицируемых
структур. Такие методики в сочетании с растровой электронной микроскопией
высокого разрешения позволяют изучать природу, распределение и
динамические свойства антигенных и рецепторных состояний на поверхности
клеткн. Методы нанесения меток на поверхность клетки в общем случае
достаточно сложны и включают процедуры иммунохимической и биохимической
очистки. Подробные ссылки на них можно найти в работах [359-361], но
сущность методик состоит в следующем. Для крепления антител в
определенных антигенных состояниях на поверхности клетки используются
стандартные иммунологические процедуры. Хитрость состоит в том, чтобы
модифицировать антитела таким образом, чтобы они также несли
морфологически различимую метку, такую, как латексные шарики или сферы из
двуокиси кремния, распознаваемый вирус, как, например, вирус табачной
мозаики, или один из Т-четных фагов, как показано на рис. 11.18, илн
белковая молекула известных размеров, как ферритин или гемоцианин. В
работе [362] (рис. 11.19) использовались гранулы золота, которые имеют
большой коэффициент вторичной электронной эмиссии. Одна часть антитела
имеет средство для специфичного антигенного закрепления на поверхности
клетки, в то время как другая часть несет морфологически различимые
структуры. В настоящее время иммунологические методы достигли такого
уровня, когда они не могут быть использованы для изучения как
качественных, так и количественных характеристик поверхности клетки [363,
364].
Препарирование биологических объектов для РЭМ
245
Хотя методы окрашивания, гистохимические и иммунологические методы не
обладают специфичностью и разрешающей способностью рентгеновского
микроанализа, проводить их гораздо проще, и они не требуют сложного и
дорогостоящего оборудования.
11.3.7. Обезвоживание образца
Как указывалось ранее, одной из центральных проблем препарирования
биологических тканей является удаление или иммобилизация воды. Процедуры
для иммобилизации воды основываются на методиках замораживания и
рассматриваются в следующей главе, посвященной микроанализу. Методы
обезвоживания для РЭМ могут быть теми же, что и для ПЭМ, и включают либо
пропитку ткани этанолом, метанолом или ацетоном с возрастающей
концентрацией и последующую сушку в критической точке, либо лиофильную
сушку при низком давлении. Какой из этих двух методов лучше, является
спорным вопросом, и необходимо делать компромисс между экстракцией ткани
и ее усадкой, возникающими в первом случае, и повреждениями, причиняемыми
кристаллами льда, в последнем случае. Какой бы из двух методов не
использовался для обезвоживания, следует ясно представлять, что неизбежно
должны иметь место некоторые изменения объема ткани. Бойд с сотрудниками
проделали серию тщательных исследований по изменению объема, которое
происходит в различных растительных и животных тканях после различных
режимов обезвоживания. Они установили, что материал, подвергавшийся сушке
в критической точке, может дать усадку вплоть до 60%; материал,
подвергавшийся лиофильной сушке, - вплоть до 15%, а материал, высушенный
от летучих жидкостей на воздухе, теряет около 80% исходного объема.
Несмотря на то что растительный материал обычно имеем меньшую усадку, чем
материал животного происхождения, каждый образец должен рассматриваться
отдельно. При условии, что измеряемое изменение объема однородно во всех
направлениях и одинаково во всех частях образца, можно производить
коррекцию любых измерений, производимых на образце.
Прежде чем приступить к обсуждению двух методов, возможно, было бы
полезным рассмотреть другие методы сушки тканей. Сушка на воздухе не
является удовлетворительной- процедурой, так как она вследствие сильного
поверхностного натяжения воды приводит к такому сильному искажению ткани,
которое может создать напряжения свыше 20-100 МПа на последних стадиях
ускорения. Эти силы становятся существенно больше по мере того, как
уменьшается высушиваемая структура (рис. 11.20). Быстрое высушивание
водной фазы образцов
246
Глава 11
д-ИМ
-I ¦¦¦¦¦к
В
11
HI
ям
Sfl
20 ним I
'W
¦Ир
Мг
шШШ
:1QC
шШ
МЩаЮИмм
¦¦Шв
1Q мкм Я
1|ЁК
Шге"'
!е
Рис. 11.20. Примеры деформации за счет сушки образцов иа воздухе.
а - ископаемое жгутиковое Prorocentrum microns; б - эвгленовидлос
жгутиковое Phacus sp.; в - ворсинки листа Solatium sarrachoides; <? -
пыльцевые зерна Роа pratense.
путем помещения их в вакуум имеет дополнительный недоста-ток, связанный с
образованием кристаллов льда в процессе испарения воды при пониженном
давлении. Образование кристаллов льда может серьезно деформировать
образец. Высушивание тканей от летучих органических жидкостей с низким
поверхностным натяжением, таких, как диэтиловый эфир или эпоксидпропан в
