Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
нескольких минут до того, как эффекты явного обезвоживания станут
очевидными. Таким же образом можно наблюдать твердые ткани, такие, как
зубы, кости, хитин, семена, споры, а также древесину и пыльцу, которые
все обладают низким содержанием воды. Исследование без применения
препарирования гораздо менее успешно с большинством тканей животных,
водяных растений и микроорганизмов, у которых ткани и клетки очень быстро
сморщиваются в процессе высушива-
220 Глава 11_________________________
ния. Однако даже такой подход не следует упускать из виду, так как
полезную информацию можно получить даже с очень сильно деформированных
образцов.
Теперь становится ясным, что, идя на компромисс за счет прибора, нельзя
достичь очень многого в смысле получения информации с биологических
объектов, и нам следует искать пути компромиссного подхода за счет
образца, позволяя ему выжить в колонне микроскопа.
11.3. КОМПРОМИСС ЗА СЧЕТ ОБРАЗЦА
Много усилий в развитии методов препарирования биологических объектов для
электронной микроскопии было сконцентрировано на разработке способов
удаления или иммобилизации воды, где были достигнуты значительные успехи.
Следовало бы отметить, что не все проблемы препарирования возникают из-за
воды. Была предпринята попытка разделить процедуры препарирования для РЭМ
на ряд определенных, но взаимосвязанных операций. Эти операции
обсуждаются приблизительно в хронологическом порядке по мере того, как
они бы использовались в процессе препарирования объекта. Для конкретной
задачи важно четко представлять, что некоторые операции могут быть вовсе
не нужными, взаимоисключающими друг друга или могут выходить из этой
последовательности.
11.3.1. Сравнительная микроскопия
При любом детальном исследовании биологического материала следует
сравнивать информацию, получаемую с помощью широкого набора приборов. Во
многих случаях полезно начинать исследования с РЭМ, поскольку его
диапазон увеличений включает в себя область увеличений от получаемых с
хорошей лупой до получаемых в просвечивающем электронном микроскопе
высокого разрешения. В РЭМ также мы получаем привычное нам изображение.
Сравнительные исследования относительно просто выполнять, подготавливая
образец либо для просвечивающего электронного микроскопа, либо для
оптического микроскопа после изучения образца в РЭМ. Пример
сравнительного исследования приведен на рис. 11.3, а дальнейшие
подробности можно найти в статьях [316-319] и в книге [320]. В работе
[321] подробно описываются методы, которые могут быть использованы для
сравнения всех трех типов изображений с гистохимическими данными, а в
статье [322] дается подробное описание сравнительных исследований в
световом микроскопе методом авторадиографии и в РЭМ.
Препарирование биологических объектов для РЭМ
221
Рис. 11.3. Корреляция изображений, полученных в РЭМ и ПЭМ [325]. а -
изображение в РЭМ изолированного комплекса Гольджи печени крысы; 6 -
изобра-жение в ПЭЛ1 негативно окрашенного комплекса Гольджи печени крысы.
222
Глава 11
Другой аспект процедуры препарирования, который необходимо обсудить, -
это понимание того, что биологические объекты, которые мы наблюдаем и
изображение которых мы регистрируем в РЭМ, являются артефактами.
Процедуры препарирования были описаны как искусство создания артефактов,
и до некоторой степени это справедливо. Вообще говоря, мы пытаемся
преобразовать нестабильный органический образец в стабильное, сугубо
неорганическое состояние. Окончательный результат представляет собой
серию амплитудно-контрастных изображений, на которых очень трудно связать
данный уровень сигнала с характеристикой живой клетки. Очень важно
понять, что наблюдаются лишь изображения, которые, хотя и представляют
живой биологический материал, но в действительности очень далеки от него.
Эта сторона электронной микроскопии убедительно доказана в исследованиях
нефиксированных и неокрашенных образцов, замороженных в гидратированном
состоянии и высушенных в замороженном состоянии образцов. На таких
образцах уже нельзя наблюдать знакомые нам изображения, получаемые более
обычными методами, и может быть хорошо, что мы начинаем переучиваться для
распознавания клеточных структур в замороженных в гидратированном
состоянии средах. Принятие того факта, что все, что мы наблюдаем в РЭМ,
является в большей или меньшей степени артефактом, ни в коем случае не
уменьшает значения этого прибора в биологических исследованиях.
11.3.2. Отбор образцов
Выбор образца должен производиться с некоторой осторожностью. Образец
должен быть наименьших размеров, сравнимых с размерами деталей, которые
нужно исследовать. С образцами малых размеров проще обращаться, и они
более адекватно обрабатываются в процессе фиксации и обезвоживания. Одним
из наихудших источников загрязнения в РЭМ является сам образец. Образцы
малых размеров могут быть наиболее адекватно застабилизированы и
обезвожены, что уменьшает вероятность выделения летучих компонент внутри
