Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
оптическом микроскопе.
Препарирование 'биологических объектов для РЭМ
227
колитического и муколитического типов, включая коллагеназу,
гиалуронидазу, нейраминидазу, эластазу, химотрипсин, проназу и некоторые
другие типы амилаз. Пример материала, очищенного с помощью коллагеназы,
показан на рис. 11.6. При исследовании некоторых твердых тканей
представляет интерес лишь неорганическая матрица. Органический материал
обычно может ¦быть удален с помощью осторожного промывания в 2-5%-ном
растворе гипохлорита натрия при комнатной температуре. Организмы с
характерным кремнистым или известковым скелетом, такие, как диатомеи,
фораминифоры и глобигерины, могут быть -очищены с помощью таких
окислителей, как марганцовокислый калин или персульфат натрия. Во всех
случаях должна соблюдаться большая осторожность для того, чтобы быть
уверенным, что удаляются лишь загрязнения, а поверхности остаются
неповрежденными. Образцы из больших многоклеточных объектов, вероятно,
лучше всего промывать до, в процессе и после иссечения, чтобы избежать
загрязнения внеклеточными жидкостями.
Водные образцы, такие, как одноклеточные водоросли, простейшие и
мельчайшие беспозвоночные, несмотря на то что хранятся в чистой культуре,
часто смешаны с широким кругом организмов и других растительных и
животных остатков. Дифференциальное центрифугирование и повторная
промывка в подходящем изотоническом буферном растворе обычно приводят к
выделению организмов из остатков или наоборот, что позволяет получить
относительно чистую суспензию. Для сухих образцов, таких, как
кальцинированные и хитиновые ткани, семена, древесина, споры, пыльца и
надземные части растений, обычно требуется лишь очистка от пыли
предпочтительно чистым воздухом, но может быть также использован
фреоновый распылитель. Такие процедуры не должны нарушать микрофлору и
грибную флору, которые являются общими чертами многих растительных
поверхностей. Недавно в работе [265] был дан обзор некоторых методик,
которые могут быть использованы при препарировании геологических
образцов, включая ископаемые растения и образцы животного происхождения.
Крепкие образцы, такие, как ткани растений и животных, могут быть очищены
в установке для катодного распыления или в холодной плазме газового
разряда.
В некоторых установках для катодного распыления можно изменять полярность
образца и мишени, что позволяет производить плазменное травление, а
возможно, и очистку поверхности. Подобным образом в кислородной плазме
газового разряда можно быстро удалять органические материалы с
поверхности неорганического образца. Такие методики следует использовать
с крайней осторожностью на соответствующим образом стаби-
228
Глава 11
лизированной ткани со скоростью травления, при которой не изменяется
поверхность образца.
Очистка поверхности не должна ограничиваться только начальными стадиями
препарирования образца, ее следует производить в любом случае, когда это
оказывается необходимым. Например, фиксация и обезвоживание могут также
изменять природу поверхностного загрязнения, поэтому проще его удалить
после этих процедур, чем до них. Многие из методбв получения изломов (см.
далее), в особенности те, которые выполняются на сухих тканях, приводят к
появлению мелких фрагментов, затеняющих образец. Такие фрагменты
необходимо удалять до перехода к следующему этапу процесса
препарирования. Теперь очищенный образец готов для проведения следующей
операции - стабилизации клеток и тканей.
11.3.4. Стабилизация образца
Стабилизация образца, или фиксация, представляет собой процесс, при
котором цитоплазма, находящаяся в весьма подвижном растворенном
состоянии, переводится в фиксированное состояние за счет процессов
осаждения и денатурации, а также за счет образования поперечных связей. В
процессе фиксации из клетки безвозвратно удаляется большая часть ионов и
электролитов, а также большое число молекул с низким молекулярным весом,
таких, как сахара и аминокислоты, остаются лишь большие макромолекулярные
комплексы.
Многие из фиксаторов, используемых для растровой электронной микроскопии,
были заимствованы из просвечивающей электронной микроскопии. Однако
имеется много важных принципиальных моментов, которые нужно иметь в виду
при выборе фиксатора. Если исследователь собирается изучать естественную
поверхность объекта или ткани или поверхность, которая была открыта и
очищалась перед фиксацией, тогда важно, чтобы фиксирующий раствор был
приблизительно изотоническим жидкостям клетки или ткани. В данном
контексте термин "фиксирующий раствор" относится ко всем другим
компонентам, нежели сам фиксатор. Он включает компоненты водного буфера,
компенсирующие ионы, электролиты и неэлектролиты, такие, как сахароза. В
работе [330] показано, что осмотичность фиксирующего раствора также важна
при получении удовлетворительной фиксации, как и реальная концентрация
фиксатора. Если образец или блок ткани после фиксации должен разрезаться
