Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ. Том 1 - Гоулдстей Дж.
Скачать (прямая ссылка):
сохранения топографии поверхности того же самого объекта, исследуемого
при малом увеличении и большой глубине фокуса. Такой целенаправленный
подход должен быть связан со средствами, имеющимися в распоряжении, и с
особенностями объекта.
Достижению конечного результата мешают огромные технические трудности. С
одной стороны, у нас имеется электронно-зондовый прибор, а с другой, мы
имеем живые биологические организмы. Взаимодействие пучка электронов с
образцом может легко вызвать как тепловые, так и радиационные
повреждения, а большие отношения сигнал/шум получаются с плоских или
тонких термодинамических стабильных образцов с большим атомным номером.
Рассмотрим теперь типичные материалы, являющиеся результатом
биологической деятельности. Они неизменно мягкие, влажные и трехмерные и
состоят из элементов с низким атомным номером и всегда с низкой
плотностью, термодинамически неустойчивы и требуют непрерывного притока
энергии, чтобы поддерживать свою форму и функциональную активность, а
также имеют низкую тепло- и электропроводность и очень чувствительны к
радиационным повреждениям.
Совершенно очевидно, что биологический материал и электронно-лучевой
прибор не соответствуют друг другу, и необходим некоторого рода
компромисс для объединения этих двух экстремальных ситуаций. Имеются две
альтернативы. Можно идти на компромисс либо за счет прибора, либо за счет
биологического материала. Будут рассмотрены оба подхода.
11.2. КОМПРОМИСС ЗА СЧЕТ МИКРОСКОПА
Для того чтобы приспособить микроскоп для использования биологического
материала без препарирования, есть два пути: 1) установить в системе
камеру объекта с контролируемой средой (газовую камеру) и 2) использовать
необычный режим работы микроскопа.
11.2.1. Камеры с контролируемой средой
В последних работах [311, 312] сделан обзор некоторых достижений в
конструировании для электронных микроскопов камер с контролируемой
средой. В таких устройствах стараются обеспечить внутри колонны
микроскопа микроклимат, подобный естественной среде, окружающей объект.
Контролируемая среда может быть достигнута за счет размещения образца в
маленькой камере, которая либо имеет окна, прозрачные для электронов,
либо отсекается от оставшейся части колонны небольшими
218
Глава 11
Piic. 11.1. Схематическая иллюстрация расположения детектора и образца
для микроскопии влажных объектов в РЭМ [311].
диафрагмами, через которые проходит постоянный, но слабый поток газа.
Внутренняя часть камеры заполняется водной средой или постоянно
заполняется насыщенным парами воды инертным газом под давлением 30-50
кПа. В любом случае, прежде чем провзаимодействовать с поверхностью
образца, электронный пучок проходит отрезок пути в несколько миллиметров
или менее в неоптимальных вакуумных условиях. На рис. 11.1 показано такое
устройство, а на рис. 11.2 приведено изображение шерстяных волокон,
которые исследовались погруженными в воду. Средняя длина свободного
пробега электрона с высокой энергией в воде или в парах чрезвычайно мала,
и неизбежное рассеяние электронов может привести как к повреждению
образца, так и к деградации изображения. Критический подход к
результатам, которые'были получены при использовании камер с
контролируемой средой, показывает, что в этом случае мы либо получаем
дополнительно очень мало новой информации биологического характера, либо
не получаем ее вообще.
Реальное преимущество такого подхода - в возможности наблюдения
динамических клеточных процессов, таких, как деление клетки. Этот
результат не был достигнут, и доказательства, приведенные в работах [313-
315], убедительно демонстрируют, что радиационные повреждения, имеющие
место во время наблюдения даже наиболее быстро размножающихся бактерий,
свели бы на нет ценность любых наблюдений с точки зрения биологии.
11.2.2. Неоптимальный режим работы микроскопа
Можно использовать микроскоп в не самых оптимальных режимах работы и все
же получать полезную информацию о необработанных биологических объектах.
Не самые оптимальные
Препарирование биологических объектов для РЭМ_______________219
Рис. 11.2. Ненапыленные обработанные параформальдегидом волокна шерсти,
частично погружённые в воду при 273 К. Ускоряющее напряжение 17 кВ.
Маркер соответствует 20 мкм [311].
режимы работы включают работу при низком напряжении, с малым током пучка,
с малым временем регистрации изображения, с худшим отношением сигнал/шум
и при худшем вакууме в колонне. При таких условиях снижается вносимая в
образец энергия и становится возможным изучение необработанных образцов
почти в естественном состоянии, хотя и при сильном ухудшении разрешения.
Такой подход, в частности, полезен при изучении растительных материалов,
клетки которых, несмотря на то что содержат большую долю воды, неизменно
окружены целлюлозной стенкой, часто покрытой водонепроницаемым или
"пробковым слоем. В чистом виде эффект состоит в уменьшении скорости
потери воды из тела растения, что позволяет наблюдать его в течение
