Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
5. Перенесите надосадок в новый центрифужный стакан, добавьте 8 г ПЭГ 6000 (полиэтиленгликоль) и 6 г NaCl (конечная концентрация 0,5 М). Растворите ПЭГ и NaCl, проинкубируйте смесь при 4°С не менее 4 ч для осаждения фага4>.
6. Соберите фаг центрифугированием в течение 20—30 мин при 10 000 об/мин и 4”С в роторе Sorvall GSA или подобном. Тщательно удалите надосадок, дайте остаткам жидкости стечь, поставив стакан на 10 мин
на бумажное полотенце.
7. С помощью пипетки на 10 мл суспендируйте осадок фага в 20 мл
10 мМ трис-НС1 pH 8,0, 50 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА. Перенесите суспензию в пластиковую центрифужную пробирку на 40 мл. Промойте стакан еще 10 мл буфера и объедините с первой порцией.
8. К 30 мл суспензии добавьте 0,6 г ПЭГ и 0,9 г NaCl. Растворите и
выдержите при 4 °С не менее 1 ч.
9. Отцентрифугируйте 10 мин при 15 000 об/мин и 4 °С в роторе Sorvall SS 34 или эквивалентном. Осторожно удалите надосадок и просушите пробирки на бумажном полотенце примерно 10 мин.
10. Пипеткой на 1 мл ресуспендируйте осадок фага в 2 мл 10 мМ трис-НС1 pH 8,0; 50 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА. Перенесите суспензию в 14 мл полипропиленовую пробирку с крышкой. Промойте центрифужную пробирку
1 мл буфера и объедините с первой суспензией.
11. Добавьте 3 мл фенола, насыщенного 10 мМ трис-НС1 pH 8,0; 0,2 мМ ЭДТА, энергично перемешайте на механическом встряхивателе и отцентрифугируйте 10 мин при 6000 об/мин и комнатной температуре.
12. Повторите экстракцию водной фазы равным объемом смеси фенола с хлороформом (1 : 1).
13. Трижды экстрагируйте водную фазу диэтиловым эфиром. После третьей экстракции удалите эфир и высушите его остатки 15—30 мин при 65 °С5>.
14. Измерьте объем водной фазы, добавьте 1/10 объема ЗМ ацетата натрия и три объема этанола (—20°С). Выдержите не менее часа при —20°С.
15. Соберите ДНК центрифугированием в роторе Sorvall SS34 в течение
20 мин при 15 000 об/мин и 0°С. Осторожно слейте надосадок и подсушите пробирку 10 мин на бумажном полотенце. Высушите осадок в вакуумном эксикаторе.
16. Растворите осадок в 2 мл 10 мМ трис-НС1 pH 8,0; 0,25 мМ ЭДТА и определите выход ДНКв>. ДНК храните при +4 или —20 °С.
’) Генотип Е. coli GM99-F2sunI — dam4, mal354, tsx, sulu (080); F'gal/T:: TnS (kanr).
Препараты фага получают на Е. colt ВМН71-18 [Ailac-pro), thl, supE; F'lac ZAM15, proA+B+].
*) Определение тнтра фаговых препаратов описано в табл. 3.
. I На этой стадии удобно проверить фенотип Dam- (табл. 2) и оттитровать фаг (табл. 3).
в! 9е деРжите эфир вблизи открытого огня или электрических выключателей.
) Выход ДНК составляет обычно 300—1000 мкг/200 мл культуры. Для фагов с атоег-мутациями, таких, как М13шр8 или М13шр9, выход может быть ниже.
Таблица 2. Проверка фенотипа Dam~
1. 1,5 мл суспензии клеток и фага (стадия 3, табл. 1) отцентрифугируйте
1 мин в микроцентрифуге. Надосадок отберите пастеровской пипеткой — он понадобится для титрования фага (табл. 3).
2. Встряхивая пробирку вручную или на механическом встряхивателе, суспендируйте осадок клеток при 0°С в 100 мкл 50 мМ раствора глюкозы; 10 мМ ЭДТА; 25 мМ трис-НС1 pH 8,0, к которому перед использованием добавлен лизоцим до 4 мг/мл. Проинкубируйте 5 мин при комнатной температуре1).
3. Добавьте 200 мкл свежеприготовленного 0,2 н. NaOH, 1% SDS и смешайте, перевернув пробирку 2—3 раза.
4. Выдержите пробирку 5 мин на льду и добавьте 150 мкл охлажденного ЗМ раствора ацетата калия (pH 4,8, подводится 98—100%-ной уксусной кислотой). Осторожно перемешайте пробирку на встряхивателе в перевернутом положении и поместите еще на 5 мин в лед.
5. Отцентрифугируйте 5 мин при 4 °С в микроцентрифуге.
6. Перенесите надосадок в чистую пробирку и добавьте равный объем смеси фенола с хлороформом (1:1 по объему). Перемешайте на встряхивателе и отцентрифугируйте 2 мин в микроцентрифуге.
7. Перенесите надосадок (водную фазу) в чистую пробирку, добавьте
2 объема этанола и 0,1 объема ЗМ ацетата натрия. Смешайте и выдержите
2 мин при комнатной температуре.
8. Отцентрифугируйте 5 мин в микроцентрифуге. Оттянутой пастеровской пипеткой осторожно удалите надосадок. Добавьте 1 мл 70%-ного этанола, перемешайте и отцентрифугируйте снова 5 мин в микроцентрнфуге.
9. Удалите надосадок так, как указано выше, и высушите осадок в вакуумном эксикаторе.
10. Растворите осадок в 20 мкл 10 мМ трис-НС1 pH 8,0; 0,25 мМ ЭДТА, содержащем 20 мкг/мл свободной от ДНКаз панкреатической РНКазы. Добавьте 3 мкл 500 мМ NaCl; 100 мМ трис-НС1 pH 7,5; 100 мМ MgCl2; 10 мМ ДТТ и 6 мкл воды. Добавьте 1 мкл МЬоХ (10 ед/мкл) и проинкубируйте 1 ч при 37 °С.
11. Проанализируйте ДНК гель-электрофорезом в 1—1,5%-ной агарозе. Причины отсутствия рестрикции могут быть следующими: 1) реверсия штам-ма-хозяина к фенотипу Dam+; 2) неактивная рестриктаза; 3) низкое качество препарата ДНК.
¦) Эта и последующие стадии выделения ДНК представляют собой вариант методики, разработанной Бирибоймом и Доли и описанной на стр. 368—369 работы [20].
