Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
15. Определите выход ДНК6) спектрофотометрически, используя для сравнения последний диализный буфер. Соотношение поглощенной Агбо/Агво должно быть близко к 2,0. Храните ДНК при —20 °С.
5) Штамм В. coli ВМН 71-38 описан в примечании 2 к табл. 1.
2) Суспензия фага готовится так, как указано в пунктах 1—4 таблицы 1.
3) Brij 58 представляет собой моностеарнловый эфир полиэтиленгляколя.
4) Раствор для уравновешивания: это 50 мМ трис-НС1 pH 8,0, на каждый миллилитр которого добавлены 0,97 г CsCl и 20 мкл раствора этиднумбромида {10 мг/мл).
*) См. примечание 5 к табл, 1.
8) Выход должен составлять от 100 до 400 мкг РФ-ДНК с 1 литра культуры.
Таблица 5. Приготовление частично дуплексной ДНК (чдДНК)
1. Расщепите 5 мкг метилированной РФ-ДНК вектора М13 рестриктазой (рестриктазами), использовавшимися для клонирования фрагмента-мишени мутагенеза. При помощи электрофореза небольшой аликвоты в 0,8%-ном агарозном геле1) убедитесь, что РФ-ДНК полностью перешла в линейную форму.
2. Смесь после рестрикции экстрагируйте дважды фенолом, насыщенным буфером ТЕ2), четыре раза эфиром, осадите ДНК этанолом и соберите центрифугированием 3>.
3. Осадок линеаризованной ДНК растворите в буфере ТЕ при конечной концентрации 0,5 мг/мл.
4. В микроцентрифужной пробирке на 1,5 мл смешайте 5 мкг (1 пМ) линеаризованной РФ-ДНК с 12,5 мкг (5 пМ) неметилированной оцДНК рекомбинантного фага. Добавьте 7 мкл раствора 10XSSC4> и доведите объем водой до 70 мкл.
5. Выдержите пробирку 7 мин в кипящей водяной бане. Чтобы крышка не открылась, ее можно прижать, положив ка пробирку предварительно прогретый металлический брусок. Перенесите пробирку на 10 мин в баню с температурой 65 °С.
6. Охладите пробирку до 0°С, добавьте 30 мкл буфера для нанесения5' и перемешайте Юс на механическом встряхивателе. Нанесите в широкую лунку на 1%-ный агарозный гель3). В отдельную небольшую лунку нанесите маркер (250 нг РФ-ДНК) и проведите электрофорез 16 ч при ЗОВ7'. Окрасьте гель в водном растворе этидиумбромида (1 мкг/мл). Видимые при УФ-освещении три зоны соответствуют одноцепочечной ДНК, линеаризованной РФ-ДНК и движущейся медленнее всех чдДНК-
7. Вырежьте полосу геля, содержащую зону чдДНК (мигрирует вместе С релаксированной РФ-ДНК маркера). Вырежьте в геле окошко, несколько большее по размеру, чем вырезанная полоса, и проложите его диализной мембраной. Положите в это окошко полоску геля с чдДНК и залейте электрофоретическим буфером так, чтобы он слегка покрывал полоску. Подайте напряжение (150—200 В) и дождитесь, пока весь окрашенный материал не выйдет из вырезанной полосы (обычно около 30 мин). На 30 с измените полярность напряжения.
8. Соберите буфер, содержащий чдДНК- При необходимости препарат можно сконцентрировать до 400—500 мкл, встряхивая его с м-бутанолом либо с помощью лиофилизации.
9. Дважды экстрагируйте раствор ДНК насыщенным ТЕ фенолом, один раз — смесью фенол/хлороформ (1:1 по объему) и 4 раза — диэтиловым эфиром. Удалите остатки эфира при 65 °С8>.
10. Дважды осадите ДНК этанолом9). Растворите осадок ДНК в 20 мкл буфера ТЕ.
Мутагенез в рекомбинантных нитевидных фагах
201
Продолжение
11. Отберите аликвоту в 1 мкл и нанесите на 1%-ный агарозный гель. Нанесите на тот же гель 1 мкг, 500, 250 и 62,5 нг ДНК фага Л, расщепленной Hindlll, и 250 нг РФ-ДНК- Проведите электрофорез 2—4 ч при 60 В. Оцените выход ДНК, сравнивая интенсивность полосы чдДНК с интенсивностью полосы 9,3 т. п. н. Л-ДНК, расщепленной Hindlll. Полоса длиной 9,3 т. п. н. содержит Vs всей Л-ДНК- Храните раствор чдДНК при —20 °С.
1) УФ-фотография такого геля представлена на рис. 1.
2) ТЕ содержит 10 мМ трис-НС1 pH 8,0; 0,25 мМ ЭДТА.
8) См. стадии 13—14 табл. 1.
4) 10XSSC — это 1,5 М NaCl; 0,15 М цитрат иатрня.
6) Буфер для нанесения содержит 60% сахарозы; 0,05% бромфенолового синего; 0,05% ксилолцианола FF; 90 мМ трис-боратного буфера pH 8,3; 2,5 мМ ЭДТА.
е) Размер геля-—123 ммХ82 ммХ5 мм, размер лунки для нанесения —1,4 ммХ 31 ммХЗ,5 мм.
7) Электрофорезный буфер содержит 40 мМ трис-ацетата pH 7,4; 5 мМ ацетата натрия; 1 мМ ЭДТА.
8) См. примечание 5 к табл. 1.
9) См. стадии 7—9 табл. 2.
Ф. Сэнгером и соавт. [16, 17]. Для анализа последовательности этим методом, однако, необходимо синтезировать еще одну олигонуклеотидную затравку.
В таблицах 8 и 9 приведена слегка модифицированная в сравнении с опубликованной [17] методика определения последовательности ДНК. Если выход генетического маркера
У
I ? 3 4 5 6 7 8
Рис. 1. Электрофоретический анализ промежуточных продуктов конструирования чдДНК- Дорожки 1 и 8 — расщепленная ЯшсПП Л-ДНК; дорожка 2 — РФ-ДНК М13тр2; дорожка 3 — укороченная линеаризованная РФ-ДНК М13тр2 (расщепленная ?coRI и Pvul)\ дорожка 4 — одноцепочечная ДНК М13тр2; дорожка 5 — смесь ДНК дорожек 3 и 4; дорожка 6 — та же смесь, что в дорожке 5, после денатурации — ренатурации; дорожка 7 —очищенная чдДНК. Получение препаратов ДНК и электрофорез описаны в табл. 5.
