Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
3. Traboni C., Ciliberto G., Cortese R. Cell, 36, 179 (1984).
4. Dente L., Cesareni GCortese R. Nucleic Acids Res., 11, 1645 (1983).
5. Zakour R. A., Loeb L. A. Nature, 295, 708 (1982).
6. Borrias W. E., Wilshut J. Т. C., Vereijken J. М., Weisbeck P. J., Van Ar-kel G. A. Virology, 70, 195 (1976).
7. Traboni C„ Ciliberto G„ Cortese R. EMBO J., 1, 415 (1982).
8. Ryan H. J., Belagaye R., Brown E. L., Fritz H. I., Khorana H. G. J. Biol. Chem., 254, 10803 (1979).
9. Shortle D„ Nathans D. J. Mol. Biol., 131, 801 (1979).
10. Everett R. D„ Chambon P. EMBO J., 1, 433 (1982).
11. Folk W. R., Hoffstatter H. Cell, 33, 585 (1983).
12. Ciampi M. S., Melton D. A., Cortese R. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79;.
1388 (1982).
190
Глава 7
13. Wieriga В., Meyer F., Reiser Welssmann C. Nature, 301, 38 (1983).
14. Shortle D„ Grisafi P., Benkovic S. J., Botstein D. Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 79, 1588 (1982).
15. Kramer W., Schughart K, Fritz H. J. Nucleic Acids Res., 10, 6475 (1982).
16. Silhavy Т. I., Berman M. L., Enquist L. W. Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1984.
17. Vieira ]., Messing J. Gene, 19, 259—268 (1982).
18. Lorenzetti R., Cesareni G., Cortese R. Mol. Gen. Genet., 192, 515 (1983).
19. Mileham A. J., Revel H. R„ Murray N. E. Mol. Gen. Genet., 197, 227 (1980).
20. Windass ], D„ Brammar W. J. Mol. Gen. Genet., 172, 329 (1979).
21. Parkinson J. S., Davis R. W. J. Mol. Biol., 56, 425 (1971).
22. Messing J., Gronebom B., Muller-Hilt B., Hofschneider P. H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 3642 (1977).
ГЛАВА 8
НАПРАВЛЯЕМЫЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДАМИ МУТАГЕНЕЗ В РЕКОМБИНАНТНЫХ НИТЕВИДНЫХ ФАГАХ
Ханс-Иоахим Фриц
1. Введение и теоретическое обоснование метода
1.1. Направленный мутагенез и конструирование мутаций
С недавних пор внимание исследователей привлекли методы направленного мутагенеза. С их помощью удается вызывать мутации с частотой до нескольких процентов, что позволяет проводить генетический анализ даже при отсутствии внешне заметных изменений фенотипа. Для идентификации мутаций можно использовать биохимические методы, а генетический анализ вести не так, как обычно, — от фенотипа к гену, а в обратном направлении. Важно, что мутации, полученные в результате направленного мутагенеза, часто не менее, а даже более интересны, чем возникающие при спонтанном мутагенезе или полученные традиционными методами.
Существуют две категории методов направленного мутагенеза.
Первые позволяют вводить в более или менее точно определенные последовательности-мишени необходимое число точ-ковых (единичных) мутаций. С помощью методов, относящихся ко второй категории, в мишени создаются сложные, точно заданные изменения. Области применения этих методов не перекрываются, а выбор того или другого из них зависит от цели конкретного эксперимента.
Из второй группы наиболее часто применяется метод восстановления генетического маркера [1], введенного в синтетический олигонуклеотид [2]. Фрагмент-мишень мутагенеза клонируют в подходящем векторе — обычно производном нитевидного фага (например, серии М13шр). Мишенью для мутагенеза служит одноцепочечная ДНК, выделенная из рекомбинантного фага. Затем синтезируют короткий фрагмент комплементарной цепи (обычно длиной около 15 нуклеотидов), содержащий нужные изменения в структуре. Синтетический олигонуклеотид отжигают с комплементарным участком ДНК-мишени и используют в качестве затравки для ферментативного синтеза in vitro полной двухцепочечной ДНК Полученная в результате молекула ДНК комплементарна по всей длине, за исключением участка, где одна из цепей несет структурные изменения. Этот гетеродуплекс используют для трансфекции клеток Е. coli, а из полученного фагового потомства отбирают частицы, со-
192
Глава 8
держащие (—)-цепь ДНК, так как именно она содержит синтетический олигонуклеотид.
Этот метод исключительно гибок и позволяет производить различные изменения в структуре ДНК- С его помощью можно получать точковые мутации, делеции и вставки. Если используют чистую, однородную по структуре затравку, то в результате экспериментов такого типа образуются одиночные легковыявляемые мутации. При использовании методов категории 1 образуется несколько мутаций.
Главные преимущества метода состоят в следующем.
1. Рабочие гипотезы о структурно-функциональных взаимоотношениях в биологических макромолекулах можно проверить строгим и прямым экспериментом.
2. Если представления о структурно-функциональных взаимоотношениях в данной биологической макромолекуле развиты в достаточной степени, то этим же методом можно направленно изменить свойства данной молекулы. Первые результаты, полученные при использовании такого подхода, уже опубликованы [3].
1.2. Основы биологии фага М13
Для направляемого олигонуклеотидом мутагенеза требуется одноцепочечная .ДНК-мишень, с которой гибридизуют мутагенную затравку. Удобнее всего клонировать ДНК-мишень в производных фага М13, поскольку в этом случае возможно «биологическое разделение цепей». Основные этапы жизненного цикла фага М13 охарактеризованы в одной из глав книги [18]. Векторы на основе фага М13 получены путем введения в его геном короткого фрагмента lac-ДНК Е. coli. Этот фрагмент содержит также несколько участков расщепления рест-риктазами [4]. Фаг М13 инфицирует клетки Е. coli, присоединяясь к F-пилям. Таким образом, для работы с векторами на юснове М13 пригодны лишь F+- и Hfr-штаммы.
