Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
9. Добавьте 100 мкл хлороформа, перемешайте механически и отцентрифугируйте 2 мин. Перенесите 90 мкл водной (верхней) фазы в чистую пробирку.
10. Добавьте 10 мкл ЗМ ацетата натрия и 300 мкл охлажденного до —20 °С этанола. Выдержите не менее часа при —20 °С.
11. Отцентрифугируйте 15 мин при 15 000 об/мин и 4°С в роторе Sorvall SS34 или эквивалентном. Удалите надосадок оттянутой пастеровской пипеткой. Добавьте 1 мл холодного этанола и перемешайте механически в течение 10 с на встряхивателе типа Vortex. Отцентрифугируйте снова. Удалите надосадок пастеровской пипеткой и высушите осадок (обычно невидимый) в вакуумном эксикаторе.
12. Растворите осадок в 25 мкл буфера ТЕ и храните ДНК при —20 °С. При возможности перед использованием проанализируйте ДНК-матрицу электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Для оценки концентрации выделенной ДНК нанесите рядом ДНК М13 с известной концентрацией и сравните интенсивности свечения зон в ультрафиолете. Не используйте ДНК-матрицу, содержащую в заметных количествах минихромосомы или тРНК, так как при этом на геле для определения последовательности могут появиться дополнительные полосы.
13. Чтобы сохранить клоны, перенесите оставшийся 1 мл каждой из инфицированных культур (стадия 3) в микроцентрифужную пробирку. Отцентрифугируйте 5 мин в микроцентрифуге и перенесите надосадок в чистую пробирку. Не старайтесь перенести надосадок количественно. Суспензию фага храните при 4 °С.
’) Генотип Е. coli ВМН 71-18 описан в примечании 2 к табл. 1.
2) См. примечание 2 к табл. 5.
Таблица 9. Анализ последовательности ДНК методом терминации цепи
1. Приготовьте 0,5 мМ растворы dATP, dGTP и dTTP и с их помощью приготовьте следующие четыре смеси (мкл):
2. Приготовьте растворы 2',3'-дидезоксинуклеозид-5'-трифосфатов: 0,1 мМ ddATP; 0,1 мМ ddCTP; 0,3 мМ ddGTP и 0,5 мМ ddTTP.
3. Смешайте равные объемы А° и 0,1 мМ ddATP; С° и 0,1 мМ ddCTP; G° и 0,3 мМ ddGTP; Т° и 0,5 мМ ddTTP. Далее эти растворы называются А-, С-смесью и т. д.
4. Приготовьте смесь всех четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов, каждый в концентрации 0,25 мМ.
5. Отожгите затравку с матрицей. Для этого в микроцентрифужной пробирке смешайте 250 нг (100 фмолей) ДНК-матрицы (обычно 2,5 мкл ДНК, приготовленной согласно табл. 8), 100—200 фмолей затравки для секвени-рования ДНК (растворенной в 1—4 мкл) и 1 мхл буфера (500 мМ NaCl, 100 мМ трис-НС1 pH 7,5; 100 мМ MgCl2; 10 мМ ДТТ). Доведите объем до 10 мкл водой. Прогрейте смесь 5 мии при 65 °С. Медленно (в течение 1—2 ч) дайте смеси остыть до 20—30 °С. Перенесите в лед.
6. Пока смесь остывает, приготовьте денатурирующий полиакриламидный гель с градиентом буфера так, как описано в работе [21].
7. Приготовьте по пробирке для каждой из четырех реакций и надпишите их G, А, Т и С. Добавьте в них соответственно по 2 мкл G-, А-, Т-и С-смеси.
8. К смеси матрицы с затравкой добавьте 1 мкл [сс-32Р] dCTP (400 Ки/ммоль; 10 мкКи/мкл) и 1 мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы (1 ед/мкл)1).
9. Нанесите по 2,5 мкл этой смеси на край каждой из четырех реакционных пробирок. Начните реакцию, «посадив» капли на дно в микроцентрифуге.
10. После 15 мин инкубации при комнатной температуре добавьте тем же способом (стадия 9) по 1 мкл смеси четырех нуклеотидов (стадия 4) и проинкубируйте еще 15 мин при комнатной температуре.
11. Остановите реакцию2), добавив 45 мкл ЗМ ацетата натрия и 250 мкл холодного этанола. Смешайте и поместите на 30 мин в холодильник (—20 °С).
12. Отцентрифугируйте пробирки 15 мин при 15 000 об/мин и 0°С в роторе Sorvall SS34 или эквивалентном. Удалите надосадок оттянутой пастеровской пипеткой.
13. Отцентрифугируйте 1 мин в микроцентрифуге и удалите все остатки надосадка оттянутой капиллярной пипеткой.
14. Высушите осадок в вакуумном эксикаторе и растворите в 2 мкл 80%-ного формамида; 10 мМ NaOH; 1 мМ ЭДТА; 0,1% ксилолцианола FF;
0,1% бромфенолового синего. Прогрейте 2 мин при 95 °С и нанесите на денатурирующий полиакриламидный гель.
*) 1 единица фрагмента Кленова ДНК-полнмеразы I — это количество фермента, включающее 10 нмоль нуклеотидов в кислотонерастворимую фракцию за 30 мин. Еслн концентрация фермента слишком велика, разбавьте его 50 мМ калий-фосфатным буфером pH 7,2 с 50% глицерина.
2) Другой метод остановки реакции (после стадии 10)—добавить 6 мкл деионизованного формамида, содержащего 0,3% ксилолцианола FF; 0,3% бромфенолового синего и 20 мМ ЭДТА. Прогрейте 3 мин при 95 °С и нанесите 2 мкл на денатурирующий полиакриламидный гель.
А° С0
1 20
20 20
20 20
20 20
G° Т°
0,5 мМ dATP 0,5 мМ dGTP 0,5 мМ dTTP Вода
20 20 1 20 20 1 20 20
Мутагенез в рекомбинантных нитевидных фагах
205
невысок, можно провести только одну из четырех реакций определения последовательности, что позволит проанализировать на одном геле более 12 клонов.
