Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Мутагенез в рекомбинантных нитевидных фагах
195
При использовании этого метода воспроизводимый выход мутантной ДНК составляет около 45% (без предварительного обогащения ковалентно замкнутой кольцевой ДНК для трансфекции). Выход достаточно высок для того, чтобы можно было обойтись без скрининга большого числа клонов. В отсутствие легкоузнаваемого фенотипа наиболее экономный путь скрининга для небольшого числа клонов — это прямой анализ последовательности ДНК.
1.6. Ограничения метода
Описанный выше метод направляемого олигонуклеотидом мутагенеза имеет ряд общих и частных ограничений.
1. Присутствие в последовательности-мишени повторов может приводить к трудностям с отжигом затравки. Прямые повторы приводят к неоднозначному выбору затравкой участка гибридизации. Обращенные повторы могут образовывать шпилечные структуры, что приводит к невозможности отжига затравки.
2. Не все неспаренные участки ДНК подвержены зависящей от метилирования репарации в равной степени [13, 15]. Поэтому, хотя описанный здесь метод во всех случаях предотвращает невыгодно направленную репарацию неспаренных участков, не следует рассчитывать, что нужным образом направленная репарация будет в каждом случае приводить к повышению выхода мутантной ДНК (в сравнении с пассивным разделением цепей).
2. Экспериментальные методики
2.1.Синтетическая затравка
Синтетические олигонуклеотиды, используемые для мутагенеза, должны быть максимально чистыми и количественно фосфорилированы по б'-концам. Такие олигонуклеотиды можно синтезировать разными химическими методами или получить из нескольких коммерческих источников. В серии «Practical approach» имеется книга, целиком посвященная препаративным и аналитическим аспектам химического синтеза олигонуклеотидов [19].
Исходя из накопленного опыта, можно сформулировать следующие требования к мутагенной затравке.
1. Длина затравки. Мутагенная затравка состоит из основной последовательности, остающейся неспаренной после отжига с геномом М13, и двух фланкирующих последовательностей, необходимых для образования стабильного и специфичного двухцепочечного комплекса. При нормальном содержании G+ +С и длине неспаренной последовательности только в один
13*
196
Глава 8
нуклеотид длина обеих фланкирующих последовательностей должна быть приблизительно 6—7 нуклеотидов. Эти последовательности должны быть длиннее, если они обогащены А+Т и(или) если длина неспаренной центральной области превышает 1 нуклеотид.
2. Последовательности вблизи концов затравки. Плохое спаривание концов отожженной с матрицей затравки мешает действию ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы. В частности, по косвенным данным, полученным в лаборатории автора, 5'-ко-нец затравки может легко смещаться, что приводит к вредным последствиям (Б. Крамер, В. Крамер, X. Фриц, неопубликованные данные). Желательно, чтобы концевые последовательности затравки содержали один или несколько остатков G или С.
2.2. Получение частично дуплексной ДНК
Гемиметилированную чдДНК получают из неметилирован-ной одноцепочечной рекомбинантной ДНК и метилированной РФ-ДНК вектора М13. Их получение описано в работе [4]. В таблицах 1—4 приведена несколько модифицированная версия этих методик.
Приготовив эти препараты, согласно табл. 5, получают чдДНК. На рис. 1 представлены результаты электрофореза различных промежуточных продуктов этого процесса. Отметьте, что чдДНК мигрирует в геле медленнее, чем любой из двух исходных компонентов.
2.3. Получение мутаций
При наличии гемиметилированной чдДНК мутагенез проводят в четыре стадии (табл. 6, 7).
1. Отжиг мутагенной затравки с чдДНК.
2. Достройка брешей и сшивание цепей при помощи ДНК-полимеразы и ДНК-лигазы.
3. Трансфекция Е. coli и получение смешанной популяции фагов.
4. Реинфекция Е. coli смешанной популяцией при очень низкой множественности заражения для обеспечения полной сегрегации маркеров.
2.4. Анализ
Полученные индивидуальные фаговые клоны необходимо проверить на присутствие желаемой мутации. Удобнее всего сделать это с помощью прямого анализа последовательности ДНК небольшого числа клонов-кандидатов. Для анализа последовательности ДНК в рекомбинантных геномах М13 больше всего подходит метод терминации цепей, разработанный
Таблица 1. Получение неметилированной одноцепочечной ДНК рекомбинантного фага (оцДНК)
1. Инкубируйте 2—3 мл жидкой культуры E.coli GM99-F2suui1) в течение ночи при 32 °С в среде с антибиотиком № 3 (Antibiotic Medium 3, Difco).
2. Внесите инокулят в 200 мл той же среды (в 1 л колбе Эрленмейера). Добавьте 0,1—0,2 мл суспензии фага2) с титром около 1012 б. о. е/мл3). Инкубируйте в течение ночи на качалке при 32 °С.
3. Отберите 1,5 мл в микроцентрифужную пробирку для проверки фенотипа Dam- (табл. 2) и определения титра фага (табл. 3).
4. Остальную культуру перенесите в 250 мл пластиковый центрифужный стакан с завинчивающейся крышкой и отцентрифугируйте 30 мин при 10 000 об/мин в роторе Sorvall GSA или подобном при 4—15 °С.
