Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 90

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 253 >> Следующая

Таблица 6. Гибридизация чдДНК с мутагенной затравкой. Обработка лигазой и полимеразой
1. В микроцентрифужной пробирке на 1,5 мл смешайте 20 фмоль (100 нг) чдДНК и 400 фмоль мутагенной затравки. Добавьте 2 мкл 5Xбуфера для гибридизации1* и доведите объем до 10 мкл водой.
2. Инкубируйте смесь 7 мин при 65 °С, крышку пробирки прижмите предварительно прогретым металлическим бруском.
3. Охлаждайте смесь 5—15 мин при комнатной температуре, а затем охладите при 0 °С.
4. Добавьте 2 мкл воды и 4 мкл 10Хбуфера для достройки2*. Смешайте и добавьте 2 мкл ДНК-лигазы Т4 (2 ед/мкл)3) и 1 мкл большого фрагмента ДНК-полимеразы (0,2 ед/мкл)4>.
5. Проинкубируйте смесь 45 мин при комнатной температуре, затем остановите реакцию добавлением 1 мкл 0,5 М ЭДТА и прогревом при 65 °С в течение 10 мин.
6. Экстрагируйте смесь 1 раз 40 мкл фенола, насыщенного ТЕ5>, и трижды диэтиловым эфиром. Удалите остатки эфира при 65°Св).
7. До начала трансфекции (см. табл. 7, стадии 3—7) храните препарат во льду. Долго хранить препарат не следует.
') Буфер для гибридизации содержит 750 мМ КС1; 50 мМ трис-НС1 pH 7,5.
2) 10Хбуфер для достройки содержит 625 мМ КС1; 275 мМ трис-НС1 pH 7,5; 150 мМ MgCl2; 20 мМ ДТТ; 0,5 мМ АТР и по 0,25 мМ каждого из четырех дезоксииуклеозид-трифосфатов.
3) 1 единица ДНК-лигазы Т4 — это количество фермента, необходимое для 50%-ного лигирования расщепленной Hindlll л-ДНК за 30 мин при 16 °С и концентрации 5'-концов 0,12 мМ.
4) 1 единица ДНК-полимеразы катализирует включение 10 нмоль нуклеотида за 30 мин при использовании polyd(AT) в качестве затравки. Фермент можно разбавить 50 мМ калий-фосфатным буфером pH 7,5 с 50% глицерина.
5) См. примечание 2 к табл. 5.
6) См. примечание 5 к табл. I,
Таблица 7. Трансфекция и разделение цепей
1. Засейте 50 мл среды с антибиотиком № 3 (Difco) I мл ночной культуры Е. coli ВМН 71-181). Инкубируйте при 37 °С со встряхиванием до ОП546— 0,6.
2. Соберите клетки центрифугированием при 6000 об/мин и 4 °С в роторе Sorvall SS34 или эквивалентном. Ресуспендируйте клетки в 20 мл охлажденного во льду 100 мМ СаС12 и отцентрифугируйте снова. К осадку добавьте 10 мл 100 мМ СаС12. Снова осадите клетки центрифугированием и ресуспендируйте их в 2 мл охлажденного во льду 100 мМ СаС12. Выдержите клетки на льду не менее 30 мин.
3. Добавьте к реакционной смеси (табл. 6, стадия 7) 60 мкл охлажденного во льду 100 мМ СаСЬ, затем 200 мкл суспензии клеток с предыдущей стадии. Выдержите смесь 90 мин во льду.
4. Быстро перемешайте суспензию и проинкубируйте 3 мин при 45 °С.
5. Отберите 20 мкл суспензии и приготовьте 10-1- и 10~2-кратные разведения ее в 100 мМ СаСЬ. 100 мкл каждого из этих разведений используйте для определения эффективности трансфекции так, как описано в табл. 3, но инкубируйте чашки в течение ночи.
6. Остатком смеси для трансфекции (280 мкл) засейте 25 мл среды с антибиотиком № 3 и проинкубируйте при 37 °С со встряхиванием в течение ночи.
7. В микроцентрифужную пробирку отберите аликвоту культуры и отцентрифугируйте 5 мин. Соберите надосадок и определите титр фага (см. табл. 3). Храните надосадок при 4°С.
’) Генотип Е. cali ВМН 71-18 описан в примечании 2 к табл. 1.
Таблица 8. Приготовление матрицы для анализа последовательности
1. Засейте 100 мл среды с антибиотиком № 3 1 мл ночной культуры Е. coli ВМН 71-18*). Разлейте по 2,5 мл в стерильные культуральные пробирки объемом 15 мл.
2. Случайным образом отберите несколько бляшек, полученных на стадии 7 табл. 7. Используйте для этого тонкие стерильные стеклянные капилляры, например капиллярные микропипетки объемом 200 мкл. Содержимое бляшек внесите в культуральные пробирки.
3. Проинкубируйте со встряхиванием 5 ч при 37 °С. Отберите по 1,5 мл каждой культуры в микроцентрифужные пробирки и отцентрифугируйте 5 мин. Остаток культур сохраните (см. стадию 13).
4. Автоматической пипеткой отберите по 1 мл надосадка. Чтобы не захватить осадка, наконечник пипетки вводите по стенке, противоположной той, на которой находится осадок клеток.
5. Снова отцентрифугируйте надосадок (5 мин). Отберите 800 мкл надосадка в новые пробирки с теми же предосторожностями, что и на стадии 4.
6. К 800 мкл надосадка добавьте 200 мкл 2,5 М NaCl, 20% ПЭГ 6000. Смешайте и оставьте на 15 мин при комнатной температуре.
7. Отцентрифугируйте 5 мин и осторожно удалите надосадок пастеровской пипеткой. Просушите края пробирки бумажным полотенцем. Отцентрифугируйте 2 мин и удалите все оставшиеся следы надосадка оттянутым капилляром.
8. К осадку добавьте 110 мкл ТЕ2>, а затем 50 мкл насыщенного ТЕ фенола. Перемешайте на механическом встряхивателе (Wortex) 15—20 с. Поставьте пробирки во встряхиватель типа Эппендорф на 10 мин (при комнатной температуре), а затем снова на 15 с во встряхиватель Wortex. Отцентрифугируйте 3 мин и перенесите верхнюю (водную) фазу в чистую пробирку.
Предыдущая << 1 .. 84 85 86 87 88 89 < 90 > 91 92 93 94 95 96 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed