Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Б. Обогащение атрп-колониями с исключенной плазмидой
3. Приготовьте чашку с L-агаром. В 4 мл верхнего слоя (0,7%-ная агароза на L-бульоне) внесите 200 мкл насыщенной культуры клеток 71/18, несущих pUC8-91/3, и вылейте смесь на чашку.
4. С помощью стерильных зубочисток пересейте фаг из мутных бляшек, полученных в результате селекции с ЭДТА, параллельными штрихами на чашку, приготовленную на стадии 3. Проинкубируйте ночь при 37 °С.
5. Перепечатайте эту чашку на чашку с 4 мл верхнего слоя, содержащего 200 мкл культуры 71/18. Охладите чашки 1 ч при 4 °С, проинкубируйте ночь при 37 °С.
6. На фоне мутных штрихов должны появиться прозрачные точки. Пастеровской пипеткой отберите по одной прозрачной бляшке из каждого штриха и перенесите в 3 мл L-бульона, содержащего 500 мкг/мл ампициллина. Инкубируйте на качалке в течение ночи при 37 °С со встряхиванием.
B. Идентификация мутации со сдвигом рамки по синему цвету колоний
7. Осадите клетки из каждой культуры объемом 3 мл (стадия 6) центрифугированием. Ресуспендируйте каждый из осадков в 1 мл 10 мМ. трис-НС1 pH 8,5; 1 мМ ЭДТА и перенесите в микроцентрифужные пробирки. Осаждайте клетки 2 мин в микроцентрифуге.
8. Суспендируйте осадок в 100 мкл 15% сахарозы; 50 мМ трис-HCf pH 8,5; 50 мМ ЭДТА. Добавьте 50 мкл лизоцима (5 мг/мл).
9. Заморозьте в смеси сухого льда с этанолом и дайте оттаять при комнатной температуре.
10. Проинкубируйте 15 мин во льду. Добавьте 300 мкл холодной (0°С) воды и проинкубируйте 5 мин во льду.
11. Проинкубируйте 15 мин при 70 °С, осадите хромосомную ДНК и обломки клеток 15 мин в микроцентрифуге.
12. Удалите осадок с помощью пастеровской пипетки с загнутым концом. К надосадку добавьте 70 мкл 5 М перхлората натрия, затем 200 мкл изс?-пропанола.
13. Отцентрифугируйте 15 мин в микроцентрифуге.
14. Растворите осадок в 100 мкл 0,3 М ацетата натрия. Добавьте 300 мкл этанола и выдержите 15 мин при —70 °С.
15. Удалите надосадок и промойте осадок 70%-ным этанолом.
16. Высушите осадок в вакуумном эксикаторе и растворите в 100 мкл
воды.
17. Добавьте 20 мкл этого раствора к 200 мкл компетентных клеток
71/18, приготовленных так, как описано в примечании к табл. 4.
18. Проинкубируйте 30 мин во льду и 2 мин при 42 °С.
19. Рассейте трансформированные клетки на чашках с L-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина, 40 мкл X-gal (20 мг/мл в диметилформами-де) и 20 мкл IPTG (20 мг/мл в воде). Проинкубируйте ночь при 37°С. Появление синих колоний показывает, что исходные мутные бляшки были образованы фагом, содержащим мутацию сдвига рамки.
>) Состав L-arapa приведен в табл. о (стадия 2).
2) В приводимом примере можно провести проверку на устойчивость к тетрациклину. Отберите 3—5 отдельных мутных бляшек (для каждого из исходных прозрачных клонов> стерильными зубочистками и рассейте их на чашки с L-агаром и параллельно на такие же, но с добавлением 5 мкг/мл тетрациклина. Клоны, растущие на обычной чашке, но не растущие на чашке с тетрациклином, обнаруживаются с частотой около 5%.
Генетические маркеры для селекции индуцированных мутаций
189-
гая ? immunity), приобретаемый фагом [21 при интеграции в него плазмиды [20]. Гибридный фаг можно легко идентифицировать, так как вследствие репликации плазмиды он образует вместо мутных бляшек прозрачные (рис. 3, стадия 2, подробнее см. табл. 5). Далее происходит случайное выщепление плазмиды из генома гибридных фагов; препарат можно обогатить фаговыми частицами, из которых плазмида вырезана, (рис. 3, стадия 3), путем инкубации в присутствии хелатиру-ющих агентов [21]. Эта процедура описана в табл. 6. На данной стадии можно проверить, удалось ли перенести мутацию в содержащийся в фаге полный ген, так как эксперимент проводился с геном, обусловливающим характерный фенотип (устойчивость к тетрациклину). Если же интересующая нас мутация не имеет фенотипического проявления у Е. coli, необходимо тестировать клоны другим способом. Это можно сделать, основываясь на фенотипическом проявлении в Е. coli самой делеции, а именно на ее способности придавать колониям, несущим плазмиды pUC8-98/3, синюю окраску. Другими словами, содержащие делецию фаги можно идентифицировать при помощи «обратной» рекомбинации с плазмидой pUC8-91/3, так. как только эти фаги после цикла интеграции — вырезания могут давать плазмиды, синтезирующие активный а-пептид. Эта методика приведена в табл. 6.
Благодарности
Мы благодарим Уэнди Мозес за перепечатку рукописи. Работа, сделанная в Италии, финансировалась Progetto Finaliz-zatto Ingegneria Genetica e Basi Molecolari delle Malattie. Ere-ditarie, CNR, Рим, Италия.
Литература
1. Fritz H.-J. In: DNA Cloning, Volume I — A Practical Approach, Glover D. M. (ed.), IRL Press, Ltd., Oxford, pp. 151—163 (1985).
2. Traboni C., Cortese R., Ciliberto G., Cesareni G. Nucleic Acids Res., 11, 4229' (1983).
