Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 93

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 87 88 89 90 91 92 < 93 > 94 95 96 97 98 99 .. 253 >> Следующая

Векторы для грамотрицательных бактерий
207
собных реплицироваться в соответствующем организме. В этой главе описаны разработка и применение плазмидных векторов, пригодных для широкого спектра грамотрицательных бактерий.
2. Плазмиды с широким спектром хозяев
Многие виды бактерий располагают собственными плазмидами и фагами, которые в принципе могут служить основой для конструирования векторов, пригодных для клонирования с использованием организма-хозяина. Однако для того, чтобы из исходного репликона получить пригодный для работы вектор, требуются значительные усилия и немалое время. Поэтому конструировать для каждого изучаемого вида собственную векторную систему крайне нежелательно. К счастью, многие плазмиды грамотрицательных бактерий способны реплицироваться в широком спектре организмов. На основе таких плазмид, названных плазмидами с широким спектром хозяев, создано несколько векторов, пригодных для экспериментов по клонированию генов во многих, если не во всех, грамотрицательных бактериях.
Свойства некоторых плазмид с широким спектром хозяев , приведены в табл. 1. Кроме общего свойства—¦ неспецифично-cfn в отношении хозяина — между ними имеются значительные различия. Представители таких плазмид обнаружены в нескольких группах несовместимости — Р-1, P-4/Q, Р-6, Р-9 и W. Оказалось, что многие из них несут гены устойчивости к антибиотикам. Плазмида RP1, например, кодирует устойчивость
Таблица 1. Некоторые плазмиды с широким спектром хозяев
Плазмида Группа несовме Размер ге Фенотипические характе
стимости нома (т. п. н.) ристики1)
RK2, RP1, RP4, Р-1 60 Ар, Km, Тс, Тга+
R68, R18
RSF1010, R300B, P-4/Q 8,9 Su, Sm, Tra~, Mob+
R1162
Sa W 29,6 Km, Cm, Sp, Su, Tra+
pVSl Неклассифициро- 30 Hg, Su\ не реплицирует
вана ся в E. coli
RMS 149 Р-6 54 Cb, Gm, Sm, Su
pJP4 Р-1 52 Hg\ рост на 2,4-D
pWWO Р-9 117 рост на толуоле/ксилоле
•) Обозначения устойчивости к антибиотикам и фенотипических маркеров: Ар — ампициллин; Кпг — канамицин; Тс — тетрациклин; Su— сульфонамнды; Cm — хлорамфени-кол; Sp— спектиномицин; Hg — ионы ртути; Gtn — геитамицин; Тга+ — способность к переносу; Мо6+— способность к мобилизации конъюгативной плазмидой; 2.4-D — 2,4-ди-хлорфеноксиуксусная кислота.
208
Глава 9
К пенициллину, канамицину и тетрациклину. Впервые она была обнаружена как фактор, придающий штамму P. aeruginosa устойчивость к карбенициллину. Этот штамм ответствен за по-слеожоговые инфекции [5]. Известно, однако, что с плазмидами могут быть связаны и другие функции, например способность катаболизировать ароматические соединения. Плазмида pJP4, например, кодирует ферменты деградации 2,4-дихлорфен-оксиуксусной кислоты [6]. Некоторые из этих плазмид, в особенности RK2 (обозначаемая также RP1, RP4, R68 и R18) [5], способны передаваться при конъюгации, тогда как другие, например RSF1010 [7], нетрансмиссивны. Для обеспечения конъ-югативного переноса плазмиды требуется большая кодирующая емкость ДНК, что в значительной степени объясняет сравнительно большие размеры RK2 (60 т. п. н.) и родственных ей плазмид. Как и следовало ожидать, нетрансмиссивные плазмиды обладают много меньшей молекулярной массой. Размер RSF1010j например, составляет 8,9 т.п.н. Естественно предположить, что небольшие плазмиды могли бы стать основой для конструирования малых векторов, однако, как мы увидим ниже, это не совсем так. Хотя наибольшее количество векторов разработано на основе incQ-плазмиды RSF1010 [7], имеются также векторы, полученные из значительно более крупных плазмид Sa (29,6 т.п.н.) и RK2 (60 т.п.н.) [5, 14, 15]. Схемы конструирования и методология использования различных векторных систем очень похожи, поэтому здесь будет рассмотрена подробно только одна из них — RSF1010. Другие системы будут лишь перечислены с указанием их особенностей.
2.1. Разработка векторов с широким спектром хозяев на основе плазмид incQ/W
Плазмиды incQ RSF1010, R300B и R1162 — это три почти идентичных нетрансмиссивных многокопийных репликона длиной 8,9 т. п. н., кодирующие устойчивость к стрептомицину (Sm) и сульфонамидам (Su). Имеются подробная физическая и функциональная карты RSF1010 (рис. 1). Картированы такие структурно-функциональные элементы плазмиды, как сайты рестрикции, участки связывания РНК-полимеразы, гены лекарственной устойчивости, область, определяющая способность к мобилизации (Mob), гены трех белков системы репликации (Rep А, В и С), участки начала вегетативной репликации (Ori) и репликации при конъюгативном переносе (Nic) [9, 10]. Для того чтобы репликон использовать в качестве вектора общего применения, в него необходимо было внести ряд модификаций. Так же, как и другие плазмиды с широким спектром хозяев, плазмида RSF1010 содержит лишь небольшое число уникальных сайтов рестрикции, пригодных для клонирования
Предыдущая << 1 .. 87 88 89 90 91 92 < 93 > 94 95 96 97 98 99 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed