Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Таблица 3. Определение титра фага
1. Надосадок со стадии 1 табл. 2 разбавьте в 103, 106 и 109 раз 20 мМ фосфатом натрия, pH 7,2, содержащим 0,002% желатина.
2. Поместите четыре стерильные стеклянные пробирки объемом 12 мл, содержащие по 2,5 мл полностью расплавленного верхнего агара1), в водяную баню с температурой 45 °С. Когда агар остынет до 45 °С, внесите стерильной 1 мл пипеткой в каждую пробирку по 2 капли свежей ночной культуры Е. coli ВМН71-182).
3. Добавьте по 100 мкл соответствующего разведения фага. Перемешайте на встряхивателе и вылейте верхний агар на чашки с ЕНА-агаром3). Четвертую пробирку (без фага) рассейте тем же способом для контроля на загрязнение штамма.
4. Дайте агару застыть (около 20 мин при комнатной температуре) и проинкубируйте чашки вверх дном не менее 6 ч при 37 °С.
5. Подсчитайте бляшки и определите титр фага. Выделение фаговой ДНК
(табл. 1) стоит продолжать, если титр составляет не менее 5-10й б. о. е/мл.
Если фаг в жизненноважных генах содержит amfeer-кодоны (например, фаги
М13тр8 и М13тр9), можно работать и с несколько меньшим титром.
‘) Верхний агар содержит (иа 1 л воды) 10 г бакто-триптона (Difco); 5 г NaCl;
6,5 г бакто-агара (Difco) и 1 мл I М MgSO*.
2) Генотип Е. coli ВМН 71-18 приведен в примечании 2 к табл. 1.
3) ЕНА-агар готовят, растворяя 13 г бакто-триптона (Difco), 8 г NaCl, 2 г цитрата
натрия (дигндрата) и 10 г бакто-агара в литре воды. Смесь автоклавируют и добавляют
7 мл стерильного 20%-ного раствора глюкозы. Агар следует разлить по чашкам Петри диаметром 9 см за несколько дней до использования.
Таблица 4. Приготовление метилированной РФ-ДНК вектора
1. Вырастите 75 мл ночной культуры Е. coli ВМН 71-18/> в среде с антибиотиком № 3 (Difco) при 37 °С. Разлейте 3 л среды с антибиотиком № 3 в три стерильные колбы Эрленмейера объемом 2 л. Засейте каждую колбу 25 мл ночной культуры ВМН 71-18 и инкубируйте при 37 °С со встряхиванием до ОП546=0,5—0,6.
2. К каждой культуре добавьте 25 мл фаговой суспензии2) с титром около 1012 б. о. е/мл и продолжайте инкубацию при 37 °С еще 3—4 ч.
3. Соберите клетки центрифугированием. Слейте надосадок и при помощи 10 мл пипетки суспендируйте клетки при 0°С в 22,5 мл 25%-ной сахарозы; 50 мМ трис-НС1 pH 8,0. Если клетки центрифугировали в нескольких стаканах, добавьте в первый 22,5 мл буфера, суспендируйте клетки, перенесите суспензию в следующий стакан и так далее.
4. Добавьте 6 мл раствора лизоцима (5 мг/мл в 50 мМ трис-НС1 pH 8,0) и проинкубируйте, плавно покачивая, 10 мин при 0°С.
5. Внесите 7,5 мл 250 мМ ЭДТА pH 8,0 и проинкубируйте еще 10 мин при 0°С.
6. Добавьте 27,5 мл 50 мМ трис-НС1 pH 8,0, 1% Brij 583>; 0,4% дезокси-холата натрия; 62,5 мМ ЭДТА и снова проинкубируйте 10 мин при 0°С с плавным покачиванием.
7. Осторожно перенесите мутную и вязкую смесь в стаканчик с завинчивающейся крышкой для ротора Beckman type-30 или эквивалентного и центрифугируйте 60 мин при 4 °С и 30 000 об/мин.
8. Соберите надосадок в мерный цилиндр объемом 100 мл, стараясь не захватить вязкого осадка. Добавьте на 1 мл надосадка 0,97 г CsCl и 20 мкл раствора этидиумбромида (10 мг/мл).
9. Разделите раствор поровну между двумя 35 мл центрифужными пробирками типа «quick-seal». Заполните пробирку доверху буфером для уравновешивания4). Закройте пробирки в соответствии с инструкцией изготовителя и отцентрифугируйте не менее 14 ч при 45 000 об/мин и 15 °С в роторе Beckman VTi50 или эквивалентном.
10. После центрифугирования должны появиться две (иногда три) зоны, соответствующие одна — линейной и кольцевой релаксированной ДНК, а другая — сверхспиральной ДНК. (Иногда наблюдающаяся третья зона соответствует одноцепочечной ДНК-) Чтобы обеспечить доступ воздуха в процессе отбора зон, воткните в верхнюю часть пробирки иглу от шприца. Проткните стенку пробирки с помощью шприца чуть ниже верхней зоны (зон) и отсосите ее. Не удаляя шприца, проткните стенку пробирки другой иглой со шприцем чуть ниже самой нижней зоны, содержащей сверхспиральную ДНК, и соберите содержимое этой зоны в объеме 5 мл (на одну пробирку).
11. Перенесите отобранный материал (по 5 мл) в две пробирки на 5 мл («quik-seal») и отцентрифугируйте 18 или более часов при 45 000 об/мин и 15 °С в роторе Beckman VTi65 или эквивалентном.
12. Соберите зоны сверхспиральной ДНК, как описано в пункте 10, но в объеме 1—2 мл и отдиализуйте против 1000 объемов 10 мМ трис-НС1 pH 8,0; 50 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА.
13. ^Перенесите раствор ДНК в 14 мл полипропиленовую пробирку с крышкой и добавьте равный объем фенола, насыщенного 10 мМ трис-НС1 pH 8,0; 0,25 мМ ЭДТА. Смешайте на встряхивателе и разделите фазы
центрифугированием. Перенесите верхнюю (водную) фазу в новую пробирку и повторите экстракцию еще дважды.
14. Экстрагируйте водную фазу трижды двумя объемами диэтилового эфира. После удаления эфира прогрейте водную фазу 15—30 мин при 65°С5). Отдиализуйте 2—3 раза против 1000 объемов 10 мМ трис-НС1 pH 8,0; 50 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА.
