Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования
495
0,71 [10]. Не исключено, что два самых крупных транскрипта представляют собой не прошедшие сплайсинг предшественники как ранних, так и поздних транскриптов. Это предположение постулирует существование регуляторных механизмов, определяющих выбор сигналов сплайсинга и терминации транскрипции на различных стадиях жизненного цикла вируса. Остается неясным, находятся ли эти механизмы под контролем вирусного генома или же они свойственны дифференцирующимся кератино-цитам.
3. BPV-1 в качестве вектора
Методы, используемые для создания рекомбинантных плазмид на основе BPV-1 включают стандартные генно-инженерные манипуляции, описанные во многих руководствах по молекулярному клонированию [16]. В данной главе мы подробно рассмотрим свойства этих векторов и их трансформирующую способность. Затем мы остановимся на BPV-1-плазмидах, несущих дополнительно доминантные селективные маркеры. Эти конструкции успешно использовались для клонирования эукариотических генов и их последующей характеристики. Конкретные приемы клонирования и экспрессии чужеродных генов в BPV-векторах проиллюстрированы на рис. 6—12.
3.1, Рекомбинантные плазмиды на основе BPV-1
Для клонирования полноразмерной ДНК BPV-1 или 69Т-фрагмента использовали бактериальную плазмиду pBR322 [17] и ее делеционные мутанты рАТ152 [18], pBR327 [19] и pML2 [20]. Все эти плазмиды, за исключением pBR322, не содержат «токсичную» последовательность, соответствующую области 2067—2533 рестрикционной карты, которая, по имеющимся данным, ингибирует репликацию ДНК SV40 в клетках мартышки [20] (табл. 1).
Таблица 1. Делеционные мутанты pBR322, используемые для клонирования ДНК BPV-1
Плазмида Делеция1) Длина2) Источник
данных
pBR322 _ 4,4 [17]
рАТ153 1646---2451 3,7 [18]
pBR327 1440---2500 3,3 [19]
pML2 1095---2485 3,0 [20]
1) Нуклеотиды, ограничивающие область делеции [29].
2) Длина в т. п. и., округленная до первого десятичного знака.
496
Глава 8
Таблица 2. Рекомбинантные плазмиды BPV-I
Рекомбинантная Вектор Клонированная Сайт Источник]
плазмида область генома данных
BPV-1
pBPV-l 8-2 pBR322 Полный геном Ват HI [25]
pBPV-1 9-1 pBR322 » Hindlll [25]
pBPV69T pBR322 69Т-фрагмент HindlII-ВатШ [15]
pBVl pAT153 Полный геном Hindlll [26]
pBVl-Dl pAT153 69Т-фрагмент Hindlll-BamHI [22]
pdlBPV69T pML2 » Hindlll-BamHl [25]
pdBPV69T pML2 » BamHI1) 125]
pdBPV-1 pML2d2> Полный геном Bam HI3> [25J
pB2 pBR322 » BamHI [24]
pMB2 pML2 » BamHI [24]
pMH4 pML2 » Hindlll [24]
pM69 pML2 69Т-фрагмент Hindlll-BamHl [24]
О Плазмида pdBPV69T получена из pdlBPV69T в результате конверсии уникального Hindlll — сайта в сайт BamHI.
2) Плазмида pML2d получена путем расщепления pdBPV69T BamHI с последующей рециклизацией.
s) Плазмида pdBPV-1 получена путем введения линеаризованной BamHI ДНК BPV-1 в уникальный BamHI-сайт pML2d.
Следовательно, эти плазмиды можно использовать для осуществления BPV-1-зависимой трансформации клеток, не прибегая к предварительному разделению вирусной и плазмидной ДНК (см. ниже).
В табл. 2 приведены известные в настоящее время BPV-1 — плазмиды; их структура схематически изображена на рис. 2. Эти плазмиды были использованы для трансформации клеток линий С127 и NIH3T3 (мышиные фибробласты) [15, 21, 22, 23J и крысиных фибробластов FR3T3 [24] путем трансфекции.
Эффективность трансформации, достигнутая в типичных экспериментах, указана в табл. 3. Методика трансфекции с последующей селекцией трансформантов на основе морфологических изменений описана в табл. 4. В случае рекомбинантной конструкции на основе pBR322 как полноразмерная ДНК BPV-1, так и 69Т-фрагмент утрачивали трансформирующую способность, однако восстанавливали ее после выщепления из состава рекомбинантной плазмиды. Такое чис-ингибирование обусловлено, по всей видимости, присутствием в pBR322 «токсичной» последовательности, которая подавляет репликацию ДНК SV40 в обезьяньих клетках [20]. В противоположность этому плазмиды рАТ153 и pML2, которые утратили «токсичную» последовательность в результате делеции (табл. 1), не подавляют трансформирующую активность полноразмер-
\
\
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования
497'
А Б
Pst I
Рис. 2. Схематическое изображение «родительских» плазмид на базе BPV-1. Во всех случаях тонкой линией изображена ДНК прокариотического вектора, а жирной линией — вирусная ДНК. В качестве вектора могут выступать pBR322, рАТ153 или pML2. А. Полноразмерная ДНК BPV-1 введена в Hindlll-сайт. Показаны обе возможные ее ориентации относительно векторной ДНК. Б. Полноразмерная ДНК BPV-1 введена в BamHI-сайт. Вирусная ДНК представлена в обеих ориентациях. В. Н1п<Ш1-ВатШ-69Т фрагмент состыкован с большим Ят(Ш1-.ВатН1-фрагментом вектора. Поскольку для клонирования использованы разноименные рестрикционные сайты, возможна только одна ориентация вирусной ДНК в составе рекомбинантной конструкции. На этом, а также на всех последующих рисунках, масштаб генетической карты не соблюден; показаны только некоторые рестрикционные сайты. Стрелки указывают направление транскрипции.
