Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
2. Ограничьте каждый индивидуальный фокус небольшим кольцом из нержавеющей стали; клетки внутри кольца трипсинизируйте, инкубируя их в течение 2—3 минут при комнатной температуре в 0,1 мл стерильного буфера PBS2>, содержащего 0,25% трипсина и 1 мМ ЭДТА. На нижнюю кромку кольца следует нанести слой силиконовой смазки, чтобы обеспечить герметичность их контакта с дном культуральной чашки. С помощью пипетки отберите трипсинизированные клетки, осадите их центрифугированием и ресуспендируйте в 0,2 мл среды.
3. Смешайте суспензию клеток с 20 мл среды, содержащей 0,9% метоце-ля МС 4000 CP (Fluka) и 20—30% FCS и высейте на чашки. Повышенное содержание сыворотки увеличивает эффективность высева.
4. Инкубируйте чашки при 37 °С в течение 10 дней. К этому времени на поверхности среды становятся видны колонии.
5. С помощью пастеровской пипетки отберите индивидуальные колонии и нарастите их в свежей среде. Описанная селекционная процедура позволяет получать линии клеток, утративших реакцию контактного ингибирования и не нуждающихся в закреплении на субстрате. Опухолеродность этих клеточных линий тестируют путем подкожного введения 3—5-106 клеток бестимусным мышам.
1) Состав HBS описан в гл. 6 (разд. 5.1).
2) PBS: 8,0 г/л NaCl; 0,2 г/л КС1; 1,15 i/л Na2HP04; 0,2 г/л КН*Р04.
также индуцировать трансформацию клеток С127 с эффективностью около 100 фокусов/мкг ДНК (ДиМайо, личное сообщение). Таким образом, несмотря на то, что оба вектора имеют сходные делеции (табл. 1), плазмида рАТ153 оказывается более эффективной для клонирования 69Т-фрагмента.
Эффективность трансформации в случае использования 69Т-фрагмента составляет приблизительно 30% от таковой при использовании полноразмерного генома [15, 13]. Вероятно остальная часть генома, непосредственно не участвующая в трансформационном процессе, оказывает на него стимулирующее влияние, благодаря присутствию дополнительных транскрипционных контролирующих элементов.
Клетки, трансформированные рекомбинантными ДНК BPV-1, обнаруживают такую же морфологию и такие же свойства (рост в агаре, способность вызывать опухоли) как и те клетки, которые были трансформированы интактным вирусом [15, 21, 22]; вирусная ДНК здесь также обнаруживается в неинтегрированной форме. В клетках, трансформированных линеаризованной ДНК BPV-1, происходит ее рециклизация, так что вирусный геном присутствует в форме мономерных эписом [23]. В' клетках, трансформированных 69Т-фрагментом, циклизация вирусной ДНК сопровождается приобретением новых (клеточных?)
32*
500
Глава 8
Таблица 5. Выделение низкомолекулярной ДНК из трансформированных клеток (по методике [30])
1. Удалите среду культивирования и промойте клетки 0,15 М NaCl; 10 мМ трис-НС1 pH 7,5; стараясь не повредить монослой.
2. Добавьте 0,6% SDS; 10 мМ ЭДТА; 10 мМ трис-НС1 pH 7,5 (20 мл на 75 см2 флакон). Распределите раствор равномерно и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10—20 мин.
3. Пересейте клеточный лизат во флакон и внесите 5 мл NaCl (конечная концентрация соли 1 М); осадок сформируется немедленно. Оставьте на ночь или на более длительное время при 4 °С. В этих условиях высокомолекулярная ДНК преципитирует, а низкомолекулярная остается в растворе.
4. Центрифугируйте при 25 000 об/мин в течение 1 ч при 4 °С. Надосадочную жидкость сохраните.
5. Экстрагируйте надосадок равным объемом фенола, насыщенного 10 мМ NaCl; 10 мМ ЭДТА; 50 мМ трис-НС1 pH 8,0.
6. Центрифугируйте при 10 000 об/мин в течение 10 мин, отберите водную фазу и экстрагируйте ее равным объемом смеси фенол/хлороформ (1 : 1).
7. Центрифугируйте в тех же условиях еще раз, отберите водную фазу и осадите ДНК тремя объемами охлажденного этанола, выдержав препарат ночь или более длительное время при —20 °С.
8. Соберите осадок ДНК центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 20 мин.
9. Промойте осадок дважды 70%-ным этанолом, содержащим 0,2М NaCl, и один раз просто 70%-ным этанолом.
10. Подсушите осадок и ресуспендируйте ДНК в 0,2 М NaCl; 1 мМ ЭДТА;
10 мМ трис-НС1 pH 7,5.
11. Внесите РНКазу до концентрации 20 мкг/мл и инкубируйте при 37 °С в течение 1 ч.
12. Экстрагируйте равным объемом смеси фенол-хлороформ.
13. Повторите этапы 7—9.
14. Подсушите осадок и ресуспендируйте ДНК в 1 мМ ЭДТА; трис-НС1 pH 7,5..Препарат ДНК готов для трансфекции.
последовательностей или же дупликацией вирусных последовательностей [23]. Последнее наблюдение заставляет предположить, что для репликации ДНК необходимо, чтобы ее длина находилась в определенных пределах, независимо от источника и природы приобретенных последовательностей. Этот вывод, в свою очередь, может указывать на вероятную причину более высокой трансформационной активности полноразмерной ДНК BPV-1 по сравнению с 69Т-фрагментом.
В мышиных клетках, трансформированных интактными BPV-1-плазмидами, гибридные молекулы присутствуют в виде множественных копий интактных неинтегрированных мономеров [22, 25]. Реорганизация интактных плазмид более свойственна крысиным фибробластам; по большей части — это делеции [24J.
