Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
¦, 69-Т-фрагмент BPV-1; -------, pBR322; 5 — промотор пеог; 6 —промотор
и сигналы полиаденилирования ^feHSV-l.
506
Глава 8
Таблица 7. Трансформация мышиных клеток С127 плазмидами BPV-neor
Плазмида Колонии Количество Источник
G418 фокусов данных
pdMMTneo (302-3) 91» о») [371
pdBPV-MMTneo (342-12) 304 6*> [37]
pAG60 5102) 02> [381
pCGBPV7 34412> 1762> [38]
pCGBPV9 45292> 5732> [38]
pAG60 392‘> --- [39]
pV69 5501» 203) [39]
!) Эффективность трансформации выражена числом устойчивых к G418
колоний и количеством трансформированных фокусов в расчете иа 1 мкг
плазмидной ДНК.
2) Эффективность трансформации выражена числом устойчивых к G418
колоний и количеством трансформированных фокусов в расчете иа 1 пико
моль плазмидной ДНК.
3) Число фокусов трансформации, полученных в результате высева
в нормальной среде 500 устойчивых к G418 клеток, вместе с 5*105 иетранс-
формироваиных клеток С127.
При введении этих плазмид в мышиные клетки С127 они индуцируют формирование колоний, устойчивых к G418, а также морфологически трансформированных фокусов (табл. 7). Эффективность трансформации по устойчивости к G418 превышает эффективность трансформации тех же клеток соответствующими родительскими плазмидами, что, вероятно, объясняется присутствием энхансера BPV-1 [12, 14]. Количество
устойчивых к G418 колоний всегда больше, чем количество трансформированных фокусов (табл. 7), и большая их часть имеет фенотип нормальных фибробластов. Вместе с тем, при дальнейшем культивировании эти клетки приобретают полностью трансформированный фенотип. Методика селекции по устойчивости к G418 описана в гл. 6.
Трансформированные pdBPV-MMTneo клетки также обнаруживают устойчивость к G418 [37], в то время как многие фокусы, индуцированные плазмидами pCGBPV и pV69 чувствительны к этому препарату и содержат плазмидную ДНК с деле-цией (см. ниже) [38, 39]. Причины этого явления неизвестны.
В клеточных линиях, отобранных по устойчивости к G418, (а в случае pdBPV-MMTneo также и по признаку морфологической трансформации) плазмиды присутствуют в виде множественных мономерных эписом в количестве 20—100 копий. Эти плазмиды можно «спасать» и нарабатывать в бактериях; их структура оказывается идентичной исходным плазмидам. Любо-
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования
507
пытным исключением является плазмида pCGBPV7, которую в трансформированных клетках можно обнаружить главным образом во фракции высокомолекулярной ДНК [38]. Пока остается непонятным различие в поведении pCGBPV7 и pCGBPV9; не исключено, что оно связано с тем, что направление транскрипции ДНК BPV-1 и гена пеот совпадает в плазмиде pCGBPV7, а в плазмиде pCGBPV9 — противоположно (рис. 5Б).
В клеточных линиях, отобранных по признаку морфологической трансформации, плазмиды также присутствуют в виде множественных экстрахромосомных копий, однако здесь они обнаруживают перестройки и делеции, затрагивающие преимущественно бактериальные последовательности [38, 39]. Как мы уже упоминали, плазмида pdBPV-MMTneo представляет собой исключение, поскольку в морфологически трансформированных клетках она сохраняется в неизменном виде и может быть выделена и наработана в бактериальных клетках [37].
Учитывая способность плазмиды BPV-neo к экстрахромосом-ному существованию, следует признать ее наиболее перспективной для использования в качестве эукариотического челночного вектора, обеспечивающего возможность двойной селекции. Замедленное проявление признаков полной малигнизации у клеток, устойчивых к G418— весьма интересный феномен. Его можно объяснить необходимостью достижения порогового уровня либо в числе копий генома BPV-1 в клетке, либо в количестве BPV-специфичных трансформирующих продуктов (либо и в том и в другом одновременно). Весьма вероятно, что такие клетки находятся на разных стадиях трансформации. Этот процесс постепенно углубляется и завершается полной малигнизацией, когда накапливается достаточное количество вирусных продуктов или когда устанавливается функциональное взаимодействие этих продуктов с неизвестными пока клеточными факторами.
3.3. Эукариотические гены в BPV-векторах
Для того, чтобы выступать в роли векторов для молекулярного клонирования, BPV-плазмиды должны удовлетворять определенным требованиям. В частности, они должны обладать способностью к экстрахромосомному существованию, эффективно нарабатываться в бактериальных клетках и обеспечивать регулируемую экспрессию и полноценную транскрипцию клонированных генов. На сегодняший день в BPV-векторах клонирован целый ряд эукариотических генов (табл. 8). Соответствующие рекомбинантные конструкции присутствуют в трансформированных клетках главным образом в виде эписом; в целом клонированные гены правильно транскрибируются и экспрессируются.
