Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Теперь фильтр можно гибридизовать с меченной 32Р ДНК интересующего гена по стандартной методике [22]. После отмывки и радиоавтографии фильтра бляшки, образованные рекомбинантными вирусами, отбирают из верхней агарозы, идентифицируя их по черным пятнам на радиоавтографе. Рекомбинантные бляшки можно также отобрать с заранее приготовленной вторичной нитроцеллюлозной реплики — отпечатка с первого фильтра, содержащего клеточный монослой [7]. Достоинство описанной методики состоит в том, что она пригодна для работы с любыми клеточными линиями, пермиссивными для вируса осповакцины.
Альтернативный метод прямого скрининга вирусных бляшек — иммунодетекция экспрессируемого продукта клонированного гена. Мы использовали этот метод преимущественно для оценки чистоты полученных вирусных препаратов, однако он в равной степени пригоден и для первичной идентификации рекомбинантов. Процедура иммуноскрининга заключается в следующем.
1. Через 36—48 ч после инфицирования клеточный монослой с примерно 200 бляшками на 9-см чашке фиксируйте 10 мл холодного метанола.
2. Промойте фиксированные клетки PBSA и инкубируйте в течение 1 ч с 5 мл 4% BSA; 0,02% азида натрия на качалке при комнатной температуре.
3. Добавьте в раствор соответствующие антитела и продолжайте инкубацию еще в течение 1 ч.
4. Промойте клетки 5 раз PBSA.
5. Добавьте 5 мл 4% BSA 0,02% азида натрия, содержащего
0,5 мкКи меченного 1251 стафилококкового белка А. Инкубируйте на качалке еще в течение часа.
6. Промойте клеточный монослой 10 раз PBSA, удалите ободок культуральной чашки и экспонируйте фиксированный монослой с рентгеновской пленкой. Черные пятна на радиоавтографе указывают позиции рекомбинантных бляшек, которые можно отобрать из слоя верхней агарозы.
Наряду с меченым белком А в реакции с первыми антителами можно использовать вторые антитела (к этим первым антителам), меченные 1251 или конъюгированные с ферментом. Конъюгаты антител с ферментами дают возможность получать . окрашенные препараты так, как описано в гл. 6 данного тома. Эта методика экономит время и позволяет обойтись без радиоавтографии.
Рекомбинантные конструкции на основе вируса осповакцины_481
3. Характеристика рекомбинантов
3.1. Анализ вирусной ДНК
ДНК выделяют из очищенного препарата рекомбинантного вируса и используют для оценки чистоты вирусного препарата и анализа структуры вирусного генома. Рекомбинантную вирусную ДНК можно анализировать и без предварительной очистки вируса — просто выделяя суммарную ДНК из инфицированного монослоя, обрабатывая ее рестрикционными эндонуклеазами и гибридизуя «по Саузерну» с меченной 32Р вирусной ДНК интересующего гена. Третий подход предусматривает экстракцию суммарной ДНК из клеточного монослоя, инфицированного в присутствии [3Н]тимидина. Рестриктазная обработка ДНК, электрофорез и последующая флюорография геля выявляют отчетливые полосы, соответствующие вирусной ДНК, на слабом фоне гетерогенных фрагментов клеточной ДНК. Процедура введения в вирусную ДНК тритиевой метки заключается в следующем.
1. Инфицируйте приблизительно 107 фибробластов куриного эмбриона (CEF) вирусом, выделенным из отдельной бляшки. Инфицированные клетки инкубируйте на среде, содержащей
0,5 мкКи/мл [6-3Н]-тимидина (23 Ки/ммоль), пока вирусный цитопатический эффект (контролируемый с помощью микроскопа) не проявится у 80% клеток.
2. Удалите среду, клетки соскоблите в 5 мл 0,02% ЭДТА в PBS и осадите центрифугированием при 500 g в течение 5 мин.
3. Ресуспендируйте клетки в 50 мМ трис-НС1 pH; 7,8 1 мМ ЭДТА; 30% сахарозе и затем лизируйте при 4 °С, добавляя SDS до 1 % и 2-меркаптоэтанол до 100 мМ.
4. После 30-минутной инкубации при 4 °С внесите протеина-зу К до конечной концентрации 500 мкг/мл. Инкубируйте при 37 °С в течение 2 ч.
5. Выделите суммарную нуклеиновую кислоту, встряхивая препарат с фенолом, насыщенным 1 М грис-НС1 pH 7,5. Отберите водную фазу и экстрагируйте ее смесью хлороформ : изо-амиловый спирт (24 : 1).
6. Отберите водную фазу, добавьте к ней 1/10 объема 5М NaCl и 2,5 объема этанола и оставьте на ночь.
7. Намотайте ДНК на стеклянную палочку, высушите ее на воздухе и растворите в 10 мМ трис-НС1 pH 7,5; 1 мМ ЭДТА.
Полученную ДНК можно обрабатывать рестриктазами и фракционировать электрофоретическив 0,6%-ном агарозном геле. После 20-минутной обработки 1М салицилатом натрия гель высушивают и визуализируют меченную 3Н ДНК радио автографией при — 70 °С (на рис. 5 представлены результаты подобного экс-
31—196
482
Глава 7
У=г
RP 1 2345678 E
. 2-2- ¦¦ -I»
Рис. 5. Флуорограмма меченных 3Н HindIII-фрагментов суммарной вирусной ДНК, фракционированных в 0,6%-ном агарозном геле. RP — ДНК вируса кроличьей оспы; 1—8 — ДНК нескольких рекомбинантных форм (кроличья ос-па/эктромелия); Е — ДНК вируса эктромелии. Размер фрагментов указан в т.п.н.
перимента). Гидролизованные Hindlll [3Н]ДНК были выделены из CEF (от англ. chick embryo fibroblasts — фибробластов куриного эмбриона), инфицированных вирусами кроличьей оспы и эктромелии, а также несколькими рекомбинантными вирусами (кроличья оспа/эктромелия). Фрагменты вирусной ДНК отчетливо выделяются на фоне слабомеченной [3Н] клеточной ДНК. Последнее, вероятно, обусловлено тем, что CEF находятся в покоящемся состоянии, вследствие чего лишь небольшое количество метки включается в клеточную ДНК. При работе с другими клеточными линиями, например CV1, включение метки в собственную ДНК клеток может быть существенно выше, что в свою очередь может затруднить детектирование вирусных полос. Если рекомбинантные вирусы имеют фенотип ТК+, применение ТК~-клеток поможет преодолеть эту трудность. Описанный метод имеет то преимущество, что не требует очистки вируса и потому позволяет легко проанализировать большое число рекомбинантов. Он особенно удобен в тех случаях, когда экспериментальная задача состоит во введении деледий в вирусный геном,
