Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гловер Д. -> "Клонирование ДНК. Методы" -> 230

Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.

Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы — М.: Мир, 1988. — 538 c.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка): klonirovadnkdnkmetodi1988.djvu
Предыдущая << 1 .. 224 225 226 227 228 229 < 230 > 231 232 233 234 235 236 .. 253 >> Следующая

Разведения антисыворотки для описанной процедуры подбирают эмпирически. Чтобы снизить неспецифический фон, необходимо тщательно промывать клетки, а антисыворотку перед использованием следует центрифугировать в течение 5—10 мин на микроцентрифуге. Для иммунофлуоресцентного выявления внутриклеточных продуктов клетки фиксируют в параформальдегиде и останавливают фиксацию хлоридом аммония или культуральной средой. Затем клетки делают проницаемыми, инкубируя их в течение 10—30 мин при комнатной температуре в 0,1%-ном растворе тритона Х-100 в PBS, содержащем 0,25% BSA, после чего проводят иммунологические реакции, как описано выше. Для отмывки клеток рекомендуем следующий раствор: 100 мМ NaCl; 50 мМ трис-НС1 pH 7,5; 0,5% NP-40, 0,25% желатин (этот раствор можно использовать в качестве буфера для иммунопреципитации). Метод с применением тритона Х-100 позволяет сохранить структуру клеток неповрежденной и поэтому предпочтительнее, чем методы фиксации этанолом, метанолом или ацетоном.
Вирус осповакцины может инфицировать многие типы клеток, поэтому открывается возможность изучать транспорт специфических белков в различных дифференцированных клеточных линиях, используя рекомбинантные вирусы и иммунофлуорес-центные методы выявления экспрессируемых белковых продуктов. Одной из технических проблем здесь может быть то, что, как видно из рис. 7, уже через 4 ч после инфицирования наблюдается значительный цитопатический эффект.
4. Заключение
С помощью процедур, описанных в предыдущих разделах, можно клонировать и экспрессировать различные гетерологич-ные гены в вирусе осповакцины. К моменту написания этой главы таким путем была осуществлена экспрессия прокариотического гена хлорамфениколацетилтрансферазы [12], ряда генов ДНК-содержащих вирусов, гена, кодирующего поверхностный антиген вируса гепатита (HbsAg) [10], генов РНК-содержащих вирусов (клонированных в виде кДНК), например гена гликопротеина вируса везикулярного стоматита (неопубликованные данные), гена Plasmodium knowlesi, кодирующего поверхностный антиген [20]. В модельных экспериментах на животных было продемонстрировано, что рекомбинантные вирусы, экспрессирующие гены ряда патогенных агентов, способны защитить животное от заболеваний, вызываемых этими агентами. Так, на-
Рекомбинантные конструкции на основе вируса оеповакцины
489
пример, обезьяны, вакцинированные рекомбинантным вирусом оеповакцины, экспрессирующим HbsAg, не заболевали при заражении вирусом гепатита [21]. Примечательно, что животные, вакцинированные рекомбинантным вирусом, экспрессирующим НА вируса гриппа, продуцируют не только циркулирующие антитела, специфичные к НА, но также и цитотоксические лимфоциты, узнающие молекулы НА (Bennink, неопубликованные данные). Это свидетельствует о том, что экспрессируемый рекомбинантным вирусом в организме животного гетерологичный белок обеспечивает иммунный ответ как гуморального, так и клеточного типа.
В вирусе оеповакцины можно клонировать фрагменты экзогенной ДНК размером до 25 т.п.н. [11]. Поэтому вполне естественно ожидать, что будут сконструированы вирусы, экспрессирующие сразу несколько гетерологичных белков. Такие вирусы могут послужить основой для получения поливалентных вакцин, эффективных против различных комбинаций патогенов, встречающихся в разных географических областях. Можно предполагать, что подобные вакцины найдут широкое применение в медицине и ветеринарии.
Литература
1. Subramani S., Southern P. L. Analyt. Biochem., 135, 1 (1983).
2. Rigby P. W. J. J. Gen. Virol., 64, 255 (1983).
3. Dales S., Pogo B. G. T. Virol. Monogr., 18, 1 (1981).
4. Moss B. Poxviruses. In: Molecular Biology of Animal Viruses, Nayak D. P. (ed.), Vol. 2, pp. 849 (1978).
5. Weir J. P., Moss B. J. Virol., 46, 530 (1983).
6. Panicalli D., Paoletti E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 4927 (1982).
7. Panicalli D., Davis S. W., Weinberg R. L., Paoletti E. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 80, 5364 (1983).
8. Paoletti E., Lipinskas B. R., Samsonoff C., Mercer S., Panicalli D. Proc Nati. Acad. Sci. USA, 81, 193 (1984).
9. Mackett M„ Smith G, L., Moss B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 7415 (1982).
10. Smith G. L., Mackett М., Moss B. Nature, 302, 490 (1983).
11. Smith G. L„ Moss B, Gene, 25, 21 (1983).
12. Mackett М., Smith G. L., Moss B. J. Virol., 49, 857 (1984).
13. Weir J. P., Bajszar G., Moss B. Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 79, 1210 (1982).
14. Sam С. K., Dumbell K. R. Ann. Viol. (Inst. Pasteur), 132E, 135.
15. Nakano E., Panicalli D., Paoletti E. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1593
(1982).
16. Ensinger M. J. J. Virol., 43, 778 (1982).
17. Villareal L. P., Berg P. Science, 196, 183 (1977).
18. Joklik W. K. Virology, 18, 9 (1962).
19. Payne L. G., Krislensson K. J. Virol., 41, 367 (1982).
20. Smith G. K-, Godson G. N., Nussenzweig V., Nussenzweig R., Barnwell J., Moss B. Science, (1984), in press.
21. Moss B., Smith G. L„ Gerin J. L„ Purcell R. H. Nature, 311, 67 (1984).
Предыдущая << 1 .. 224 225 226 227 228 229 < 230 > 231 232 233 234 235 236 .. 253 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed