Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
После электрофореза полипептиды, связавшиеся в реакции иммунопреципитации, выявляются с помощью радиоавтографии.
На рис. 6 представлены результаты экспериментов, иллюстрирующие три основные методики иммунодетекции, на примере анализа экспрессии рекомбинантным вирусом осповакцины гликопротеина вируса везикулярного стоматита (штамм New Jersey). Результаты этих экспериментов демонстрируют, что все вирусы в данном препарате экспрессируют ген VSV, что продуцируемый полипептид имеет тот же размер, что и аутентичный гликопротеин, и что экспрессия гена под контролем транслоци-рованного промотора происходит аналогично тому, как она происходит под контролем промотора в его естественной позиции. Гликозилирование данного белка можно анализировать путем мечения инфицированных клеток [3Н] глюкозамином в присутствии или в отсутствие ингибитора гликозилирования, например туникамицина [23]. Иммунопреципитация и электрофорез аутентичного белка, экспрессируемого инфицированными клетками, позволяют выявить любые нарушения в структуре продукта, кодируемого клонированным геном. Процедура мечения углеводной части белка в основном та же, что и процедура пульсового мечения белка [35S] метионином, за тем исключением, что в среду с фруктозой добавляют 5—10 мкКи [3Н] глюкоза-мина [19].
3.2.2. Иммунофлуоресценция
Во всех исследованных нами случаях в клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом, наблюдались нормальный транспорт и субклеточная локализация чужеродного белка. Например, на рис. 7 представлена микрофотография, демонстрирующая поверхностную флуоресценцию гемагглютинина вируса гриппа (НА) в клетках MDCK, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины, экспрессирующим НА. Специфическое связывание флуоресцентно меченных антител к НА на поверхности клеток детектируется через 2 ч после инфицирования и происходит в тех же участках, что и в случае клеток, инфицированных вирусом гриппа. Эту микрофотографию и приведенную ниже методическую разработку любезно предоставил Майкл Рот из лаборатории Колд Спринг Харбор.
1. Фиксируйте клетки в свежеприготовленном 2%-ном растворе параформальдегида в PBS (для этой цели можно также использовать 10-кратное разведение 37%-ного раствора формальдегида) в течение 15—30 мин при комнатной температуре.
2. Отмойте формальдегид и остановите фиксацию, добавляя среду культивирования. Чтобы предотвратить неспецифическую
Рис. 6. А. Детекция экспрессии VSVnjG в индивидуальных вирусных бляшках. Показаны два монослоя клеток CV-1, содержащих бляшки, образованные вирусом оеповакцины дикого типа (WT) и рекомбинантным вирусом (v51). Инкубация с aHTH-VSVNj-антителами и затем с меченным 1251 стафилококковым белком А проводилась, как описано в разделе 2.4.5. После радиоавтографии фиксированные монослои окрасили кристаллическим фиолетовым. Окрашивание выявило приблизительно одинаковое количество вирусных бляшек на клетках, инфицированных вирусом дикого типа v51. Кроме того было показано, что каждый вирус, образовавший бляшки на клеточном монослое, инфициро-
Рекомбинантные конструкции на основе вируса осповакцины________487
Рис. 7. Поверхностная флуоресценция клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом осповакцины, экспрессирующим НА вируса гриппа. Клетки почки собаки инфицировали при множественности 3 б.о.е. на клетку и фиксировали через 4 ч после инфекции. Субклеточную локализацию НА определяли с помощью моноспецифической аффинно-очищенной кроличьей aHTH-HA-IgG-фрак-ции и козьей антикроличьей антисыворотки, конъюгированной с флуорес-цеинизотиоцианатом (ФИТЦ).
сорбцию антител клеточным монослоем, клетки инкубируйте в буфере PBS, содержащем 0,5—1% BSA или желатина, в течение 30 мин.
3. Инкубируйте фиксированные клетки с таким наибольшим разведением антисыворотки, которое еще обеспечивает получение отчетливого сигнала, в течение 1 ч при комнатной температуре.
4. Отмывайте первые антитела в PBS 5 раз по 10 мин.
ванном v51, экспрессирует гликопротеин VSV. Б. Анализ полипептидов VSV, экспрессируемых рекомбинантными вирусами осповакцины. После иммунопреципитации меченные 35S полипептиды из клеток, инфицированных v51, фракционировали в 10%-ном полиакриламидном геле. В качестве контроля использовали меченые белки из клеток, инфицированных VSV(VSVnj). Молекулярные массы стандартных маркеров (М) указаны в т.п.н. В. Иммуно-дот-анализ экстрактов клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом v51 (содержащим ДНК VSV) и вирусом осповакцины дикого типа (WT) в присутствии и в отсутствие цитозин-арабинозиза (Ага С). Полученные экстракты использовали для приготовления серии последовательных двукратных разведений (Г) от 1 : 2 до 1 : 256, которые затем тестировали на присутствие VSVnjG с помощью анти-VSVnj-антисыворотки и меченного 1251 белка А (разд. 2.4.4). Панели А, Б, В воспроизводят результаты радиоавтографии.
488
Глава 7
5. Перед реакцией с флуоресцентным конъюгатом вторых антител клеточный слой следует насытить буфером PBS-BSA. После реакции промывают клетки 5 раз PBS и визуализируют флуоресценцию с помощью источника света с соответствующей длиной волны.
