Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования
493
2.1. Структурная и функциональная организация генома BPV-1
Геном BPV-1 представлен кольцевой двухцепочечной ДНК и насчитывает 7 954 п. н. [4]. Физическая карта этого вируса была составлена в нескольких лабораториях [5—7]; не так давно определена его полная нуклеотидная последовательность [4].
В отличие от SV40 или вируса полиомы в геноме BPV-1 открытые рамки считывания расположены только на одной цепи ДНК [4], т. е. транскрипция во всех случаях происходит только в одном направлении [8—10]. Две из четырех важнейших открытых рамок локализованы в области, ответственной за трансформацию (см. ниже); они обозначены как Е1 и Е2 (от англ. early — ранние) и включают соответственно 1814 и 1229 п. н. (рис. 1 Л). Две другие открытые рамки L1 и L2 (от англ. late — поздние), расположены в структурной области генома (см. ниже) и насчитывают соответственно 1484 и 1406 п. н. (рис. 1 А). В области, определяющей трансформирующую активность вируса, локализуется еще несколько небольших открытых рамок считывания, обозначенных Е4—Е8. Последовательности L1 и L2 считываются в одной и той же фазе и разделены в геноме единственным стоп-кодоном. В то же время Е-последовательности считываются в трех рамках; некоторые из этих последовательностей частично или полностью перекрываются (рис. 1Л). Участок вирусного генома, расположенный между З'-концом L1 и 5'-концом Е6 (длиной 1000 п. н.) не содержит открытых рамок считывания. Этот чувствительный к ДНКазе1 участок [11] содержит транскрипционные регуляторные элементы, вероятно выполняющие функции промоторов [4, 12, 13] (рис. 1 5) и потому играет определяющую роль в жизненном цикле вируса. У дистального конца ранней области, необходимой для реализации трансформирующей способности BPV-1, локализуется усилитель транскрипции (энхансер) [12] (рис. 1 Б), который может быть заменен энхансером SV40 или вируса полиомы [14]. Сигналы полиаденилирования обнаружены на З'-конце ранней области (позиция 4179) и на З'-конце поздней области (позиция 7091 и 7155) [4].
Нра\-сайт соответствует 0/1,0 ед. карты. Б. Вирусные транскрипты, обнаруживаемые в трансформированных клетках, показаны открытыми стрелками. Закрытыми стрелками показаны вирусные РНК, появляющиеся в продуктивных папилломах. Пунктиром обозначены предполагаемые б'-концевые лидер-ные последовательности. Т—ТАТА-бокс; Е — энхансер; А — сайт полиаденилирования. В. Прямой линией представлен линеаризованный геном BPV-1. Зачерненные участки — цис-действующие элементы, необходимые для трансформации клеток in vitro. Пунктиром обозначена область делеции. Вверху показана открытая рамка считывания Е2. (Использованы данные, опубликованные в работах [4, 8, 9, 10, 12, 13, 14 и 15].)
494
Глава 8
2.2. Трансформирующие свойства BPV-1
Область вирусного генома, определяющая его способность трансформировать клетки и существовать в них в форме свободных эписом, локализуется в ЯшсИП-БатШ-фрагменте (5,4 т.п.н.), представляющем 69% всей вирусной ДНК [15] (рис. 1А и 1 В). Этот фрагмент получил название 69Т. Используя делеционные мутанты, Накабаяши с сотр. [13] показали, что для реализации функции трансформации необходимы два интактных сегмента 69Т-фрагмента (в цис-положении): один из них находится у 5'-конца 69Т-фрагмента и соответствует той области, где локализуются транскрипционные контролирующие элементы [12]; другой представляет собой участок длиной 2,3 т.п.н. у З'-конца 69Т-фрагмента и включает открытую рамку Е2 (рис. 1 В). В клетках, трансформированных делец ионными мутантами, содержащими описанные сегменты, обнаруживается лишь по нескольку интегрированных в геном копий вирусной ДНК; следовательно, трансформирующая способность и способность существовать в форме эписомы определяются разными областями вирусного генома. По всей вероятности, ответственной за эписомное состояние является открытая рамка считывания Е1.
2.3. Транскрипция вирусных генов
Специфические вирусные транскрипты были идентифицированы как в продуктивных клетках папилломы, так и в непродуктивных трансформированных клетках [8—10]. В трансформированных клетках присутствуют пять видов мРНК, которые, очевидно, все синтезируются на ДНК-матрицах, входящих в состав 69Т-фрагмента. Эти транскрипты имеют длину 4050, 3800, 1700, 1150 и 1050 нуклеотидов; З'-концы у них совпадают и определяются сигналом полиаденилирования в позиции 4179 [8, 9]. 5'-концы транскриптов картируются соответственно в точках
0,03, 0,34, 0,39 и 0,41 [9]. 5'-лидерные последовательности картируются отдельно в районе 0,9—0,1. Это указывает на то, что ранние транскрипты формируются путем дифференциального сплайсинга общего лидера с несколькими основными РНК.
Помимо транскриптов, свойственных трансформированным клеткам, в опухолях обнаруживаются еще пять вирусных транскриптов. Их длина составляет 8000, 6700, 3800, 3700 и 1700 нуклеотидов. 3700-нуклеотидная РНК охарактеризована недостаточно полно, и в дальнейшем мы ее обсуждать не будем. Четыре других, специфичных для опухолей транскрипта имеют совпадающие З'-концы, картирующиеся в точке 0,9, что соответствует сигналам полиаденилирования в позиции 7091 и 7155; 5'-концы этих РНК картируются соответственно в точках 0,9, 0,01, 0,42 и
