Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
Рекомбинантные конструкции на основе вируса осповакцины
483
поскольку здесь нет возможности скрининга на клонированный чужеродный ген.
Чтобы более детально охарактеризовать геном рекомбинантного вируса, из очищенного вирусного препарата нужно выделить ДНК (разд. 2.3, табл. 4).
1. Внесите в очищенный препарат вируса следующие компоненты: трис-НС1 pH 7,8 до 50 мМ; ЭДТА до 1 мМ; сахарозу до 27%; SDS до 1%; протеиназу К до 500 мкг/мл и инкубируйте при 37 °С в течение 2—3 ч.
2. Выделенную вирусную ДНК дважды депротеинизируйте мягкой фенольной экстракцией (фенол насыщен 10 мМ трис-НС1 pH 7,5; 1 мМ ЭДТА). Следует избегать действий, способствующих фрагментированию ДНК.
3. 2 раза экстрагируйте препарат смесью хлороформ: изо-амиловый спирт (24: 1).
4. Отберите водную фазу, внесите в нее NaCl до 0,5 М и осадите двумя объемами этанола.
5. Аккуратно намотайте ДНК на палочку, высушите на воздухе и мягко растворите в 10 мМ трис-НС1 pH 7,5; 1 мМ ЭДТА.
Достаточное количество вируса для анализа ДНК можно получить, инфицируя половиной или одной четвертой частью препарата, выделенного из отдельной вирусной бляшки, четыре 150 см2 флакона с монослойной культурой BSC-1 или CV1. Можно также анализировать ДНК, выделенную из частично очищенного вируса (табл. 4, А, стадии 1—4).
3.2. Анализ продукта клонированного гена
Если при клонировании сохранены в интактном виде сигналы инициации и терминации трансляции данного гена, возможна экспрессия аутентичного полипептида, который может быть охарактеризован тем или иным способом, исходя из природы клонированного гена. В том случае, когда ген кодирует фермент, определяют соответствующую энзиматическую активность в экстрактах инфицированных клеток. Этот подход был использован при клонировании гена пиримидинкиназы вируса герпеса [6, 9] и хлорамфеникол-ацетилтрансферазы [12]. Пиримидинкиназную активность определяли при помощи теста на фосфорилирование 1251-дезоксицитидина; присутствие этого фермента в клеточном экстракте свидетельствовало о том, что клонированный ген вируса герпеса экспрессируется в рекомбинантном вирусе осповакцины. Экспрессию CAT в инфицированных рекомбинантным вирусом клетках тестировали по конверсии [14С] хлорамфеникола в ацетилированную форму [12]. Этот фермент довольно устойчив к однократному замораживанию — оттаиванию, поэтому клеточные экстракты для определения CAT-активности получали именно таким способом (см. также гл. 6). Другие методы
31*
484
Глава 7
выявления экспрессируемых продуктов клонированных генов в инфицированных вирусом клетках включают радиоиммуноло-гический анализ, «вестерн»-блот-анализ, прямой иммуноскрининг вирусных бляшек (2.5.5), иммуно-дот-анализ (2.5.4), иммунофлуоресценцию (3.2.2) и иммунопреципитацию (3.2.1).
3.2.1. Иммунопреципитация
Если имеются в распоряжении необходимые антитела, наиболее подходящим методом детекции продукта клонированного гена является пульсовое мечение инфицированных клеток с последующей иммунопреципитацией чужеродного белка и электрофорезом в полиакриламидном геле.
1. Инфицируйте вирусом (дикого типа или рекомбинантным) монослойные культуры CV1 в 25 см2 флаконах при множественности 30 б. о. е. на клетку. Клетки растите в среде Игла, содержащей 0,01 мМ метионина (9 частей среды без метионина: : 1.часть нормальной среды).
2. Через 2 ч добавьте 50—100 мкКи [35S] метионина (100 Ки/ммоль).
3. Соберите клетки через 12 ч после инфицирования: промойте их 3 раза PBSA и соскоблите в PBS.
4. Ресуспендируйте клетки при 4°С в 0,2 мл 0,1 М NaCl; 0,1 М трис-НС1 pH 8,0; 0,1% Aprotinin. Медленно добавьте
0,05 мл 2,5%-ного NP-40 и оставьте при 4 °С на 10 мин.
5. Осадите ядра при 800g в настольной центрифуге. Надосадочную жидкость инкубируйте с 25 мкл пре-иммунной кроличьей сыворотки при 4°С в течение 15 ч. Добавьте 50 мкл 20%-ного раствора стафилококкового белка А (суспензии). Инкубируйте при 4°С в течение 30 мин, периодически встряхивая пробирку.
6. Центрифугируйте 2 мин в микроцентрифуге. Соберите надосадочную жидкость и инкубируйте в течение 4 ч с 25 мкл антисыворотки к продукту клонированного гена (требуемое разведение определите эмпирически). Добавьте 50 мкл 20%-ного раствора белка А и инкубируйте при 4 °С в течение 30 мин, периодически встряхивая пробирку. Центрифугируйте в микроцентрифуге в течение 2 мин.
7. Промойте осадок дважды раствором: 0,05 М трис-НС1 pH 7,5; 0,15 М NaCl; 0,1% SDS; 1% Тритон Х-100; 1% дезоксихо-лат натрия. Затем промойте осадок раствором: 0,4 м LiCl; 2 М мочевина; 10 мМ трис-НС1 pH 8,0 (LUT). Перенесите осадок в чистую пробирку Eppendorf и еще раз промойте LUT.
8. Растворите белковый преципитат в 100 мкл раствора:
0,06 М трис-НС1 pH 6,8; 3% SDS; 5% 2-меркаптоэтанол; 10% глицерин; 0,02 бромфеноловый синий. Выдержите 15 мин при 25 °С и осветлите раствор коротким центрифугированием.
Рекомбинантные конструкции на основе вируса осповакцины
485
Прогрейте раствор при 100 °С в течение 2 мин и нанесите на 10%-ный полиакриламидный гель [22].
