Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
22. Maniatis Т., Fritsch E. F„ Sambrook J. Molecular Cloning. A Laboratory Manual, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1982.
ГЛАВА 8
ВИРУС БЫЧЬЕЙ ПАПИЛЛОМЫ: ЭУКАРИОТИЧЕСКИЙ ВЕКТОР ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ
М. Саверия Кампо
1. Введение
За последние годы достигнуты большие успехи в создании векторов для молекулярного клонирования, которые позволяют экспрессировать клонированные гены в бактериальных клетках и получать целый ряд эукариотических белков в прокариотических системах.
Тем не менее особенности белок-синтезирующего аппарата бактерий накладывают определенные ограничения на возможность экспрессии в них многих эукариотических белков. Бактериальные клетки неспособны обеспечить необходимые пост-трансляционные модификации синтезируемых белков — глико-зилирование, процессинг и сборку олигомерных белков. Кроме того, клетки Е. coli, — наиболее широко распространенного бактериального хозяина, — не секретируют белки в среду культивирования. Вдобавок отметим, что изучение некоторых аспектов функционирования эукариотических генов, таких как реакция на индукторы гормональной или вирусной природы, влияние метилирования, взаимодействие со специфическими клеточными белками, просто невозможно при использовании бактериальных систем.
Следовательно, необходимы такие векторные системы, которые позволяли бы вводить клонированные эукариотические гены в эукариотические клетки и обеспечивали бы их экспрессию в контролируемом генетическом окружении. Большинство известных в настоящее время эукариотических экспрессирующих векторов являются производными вирусных репликонов. Так, для клонирования и экспрессии чужеродных генов в культивируемых клетках широко используются векторы на базе SV40 и аденовирусов (см. например, обзор [I]). Однако, эти системы имеют ряд недостатков. В частности, завершение репродуктивного цикла данных вирусов сопровождается гибелью клеток-хо-зяев, что препятствует получению клеточных линий, в которых клонированные гены могли бы реплицироваться и экспрессироваться достаточно долго. С другой стороны, непермиссивные трансформированные клетки содержат лишь несколько копий вирусной ДНК, которые стабильно интегрированы в хозяйский геном. Вот почему в данном случае, в противоположность лити-ческому циклу, в трансформированных клетках не происходит
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования
491
амплификация и экспрессия клонированных генов. Следует учитывать и то, что интеграция представляет собой случайное событие и, следовательно, нельзя контролировать, в какое генетическое окружение попадет приобретенная последовательность ДНК. Исключительная сложность эукариотического генома, влияние оказавшихся по-соседству генетических элементов, эффекты вторичных модификаций (такие, например, как структурирование хроматина и метилирование) делают невозможной адекватную оценку экспрессии чужеродных генов и анализ их функций.
Из всего сказанного ясно, что для преодоления трудностей необходим вектор, способный стабильно реплицироваться, обеспечивая независимую от хромосомного контроля репликацию и экспрессию клонированного гена, и не вызывающий лизиса клеток. Таким требованиям удовлетворяет ДНК вируса бычьей папилломы. Этот вирус (BPV-1) in vivo вызывает опухоли эпителиального и мезенхимного происхождения, a in vitro способен трансформировать клетки быка и грызунов. В инфицированных или трансформированных клетках вирус персистирует исключительно в виде множественных копий свободной кольцевой ДНК. Эта особенность его биологии обусловила повышенный интерес к нему, как к потенциальному вектору для молекулярного клонирования в эукариотических клетках (см. обзоры 2 и 3).
В данной главе мы кратко остановимся на наиболее примечательных особенностях строения и функционирования генома BPV-1, рассмотрим полученные в разных лабораториях рекомбинантные плазмиды на основе BPV-1 и их трансформирующие свойства, и кроме того коснемся целого ряда эукариотических генов, которые к настоящему времени клонированы в составе векторов на базе BPV-1.
2. Вирус BPV-1
Подробный анализ некоторых сторон жизненного цикла этого вируса несколько затруднен ввиду отсутствия подходящей системы in vitro. Вот почему наши представления о структурной и функциональной организации вирусного генома, о механизмах, регулирующих во времени его репликацию и транскрипцию, а также вопросы, касающиеся идентификации и функционирования продуктов вирусных генов, разработаны не так глубоко, как в случае других мелких ДНК-содержащих опухолевых вирусов. В то же время, клонирование вирусного генома в составе бактериальных плазмид позволило сильно продвинуться в плане изучения его молекулярно-биологических характеристик. Ниже мы кратко коснемся тех аспектов биологии вируса BPV-1, которые имеют отношение к вопросу использования его ДНК в качестве эукариотического вектора.
А
.В
Hindlll Hpal
Eco R1 —I--------
Bam HI
Hind III
Рис. 1. Структурная организация генома вируса бычьей папилломы (BPV-1). А. Зачерненный участок — трансформирующий Яг'^Ш-ВатШ-фрагмент (69% генома). Заштрихованный участок — структурный ВатШ-Hindlll-фрагмент (31% генома). Контурные стрелки — ранние (El—Е8) и поздние (LI—L2) открытые рамки считывания. Описанные ранее открытые рамки Е2 и ЕЗ оказались одной непрерывной рамкой считывания Е2: в позиции 3444 был обнаружен добавочный G (A. Stenlund, личное сообщение). Стрелками показано направление транскрипции; цифрами обозначены позиции старт- и стоп-кодонов. Первый нуклеотид уникального Hpal-сайта соответствует позиции 1;
