Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
508
Глава 8
Таблица 8. Эукариотические гены, клонированные в BPV-векторах
Рекомбинантные BPV Эукариотический Размер Последо Рису- Источ
плазмиды ген клониро ватель нок ник
ванного ге ности данных
на, т. п. н. pBR1'
pBPV69T-rIl 69Т Препроинсулин 1,62 --- 6 [43]
крысы
pBPV-3 69Т {1-Глобин человека 7,6 + 7 [46]
pGP 69Т Гормон роста кры 5,8 + 8.4 [48]
сы
pBPVMG 69Т Гормон роста че 3,5 85 [49]
ловека плюс про
мотор гена метал-
лотионеина мыши
pBPV69T-IFN,81 69Т {1-Интерферон че 1,6 - 9.4 [52]
ловека
pBPV-IF 69Т {1-Интерферон че 1,6 - 95 [53]
ловека
pM18/19 69Т MMTVLTR + 3,7 - 10 [55]
+ H-MSV v-ras
pBPV-pHLA 69Т Тяжелая цепь HLA 8,5+7,6 + 11 [56]
плюс {1-глобин че
ловека
pM26V4 Пол Поверхностный 2,7 12 [57]
ный антиген HBV
геном
’) Показано наличие ( + ) или отсутствие (---) плазмидных последовательностей в со-
ставе рекомбинантной конструкции.
3.3.1. Физическая организация
Во всех случаях, за исключением гена поверхностного антигена вируса гепатита В (HBVsAg) для клонирования перечисленных генов использовали 69Т-фрагмент BPV (табл. 8). Размер клонированных эукариотических последовательностей варьировал от 1,6 т.п.н. в случае гена препроинсулина крысы (rll) и гена p-интерферона человека (IF) в составе плазмид pBPV69T-rIl и pBPV-lF соответственно [43, 52, 53] (рис. 6 и рис. 9) до 16,1 т.п.н. Именно таков суммарный размер клонированного в составе плазмиды pBPV-pHLA фрагмента, который включает р-глобиновый ген человека длиной 7.6 т. п. н. (рис. 7) и ген HLA человека, имеющий длину 8,5 т.п.н. (рис. 11) [56].
Большинство генов было клонировано в обеих ориентациях относительно направления транскрипции ВPV-последовательностей; некоторые гены клонировали только в одной заранее определенной ориентации благодаря подбору рестриктаз (см. рис. 6, 8 Л и 9 5).
Рис. 6. Ген препроинсулина крысы в BPV-плазмиде. В BamHl-Hincll фрагменте (1,6 т.п.н.), содержащем кодирующие последовательности гена препроинсулина крысы (г11), а также его интронные участки и 5'- и З'-концевые регуляторные сигналы [44], ЯшсП-сайт был конвертирован в сайт Hindlll с помощью //t'ndIII-линкеров. Модифицированный таким образом фрагмент лигировали с 69Т-фрагментом вируса бычьей папилломы (BPV) и получившийся гибридный сегмент BPV69T-rIl ввели в сайт HmdIII-плазмиды pBR322 Перед тем, как трансформировать клетки С127, плазмидные последовательности удаляли из pBPV69T-rIl с помощью рестриктазы Hindlll. Эффективность трансформации гибридной ДНК составляла —200 фокусов/мкг ДНК. И, BPV69T;
-----, pBR322.
t \
BamM^
Ваш Н1/Чч\ х V. у
HindHIj-BamJHI^, I
Рис. 7. Ген 13-глобина человека в BPV-плазмиде. #/rad III-фрагмент (7,6 т.п.н.) fi-глобинового кластера человека [45] в обеих ориентациях был введен в сайт Hindlll плазмиды pBPV-Hll (гибрид pML2-BPV69T); рекомбинантные конструкции получили обозначение pBPV-fl. В pBPV-fll транскрипционная ориентация ДНК BPV и глобинового гена одна и та же, а в pBPV-рЗ — противоположная. Эффективность трансформации pBPV-]3 составляла —400 фокусов/мкг вирусной ДНК. И, BPV69T;-------------, pML2; —, последовательности
Р-глобинового гена. Два подчеркнутых ВатШ-сайта и две маленьких стрелки над fl-глобиновой последовательностью указывают границы делеции в мутантной плазмиде, использованной для клонирования гена ^-интерферона человека
