Клонирование ДНК. Методы - Гловер Д.
ISBN 5-03-001159-5
Скачать (прямая ссылка):
pMLBPVTK4 400 --- [14]
pAGO 25 2,8-10-2 [33]
pBPV-TK 26 7,8-10-2 [33]
') Число колоний иа 1 мкг рекомбинантной плазмидной ДНК.
2) Число колоний иа 5 мкг рекомбинантной плазмидной ДНК.
3) Число колоний на 1 иг рекомбинантной плазмидной ДНК.
3.2.2. Гибридные плазмиды BPV-gpt
В этих плазмидах доминантным селективным маркером служит ген gpt Е. coli, который функционирует под контролем раннего транскрипционного промотора SV40 [34]. Клетки, акцептировавшие и экспрессирующие бактериальный ген, способны расти на среде HAT (гипоксантин-аминоптерин-тимидин), содержащей ксантин и микофеноловую кислоту.
Рис. 4. Рекомбинантные плазмиды BPV-l-gpt. pBPV69T-SV2gpt получена следующим образом. Сначала соединили 69Т-фрагмент BPV-1 и EcoRl-Sall-фрагмент (3,7 т.п.н.) pBR322 с помощью X/toI-линкеров. После конверсии PauII-сайта pSV2gpt 11 в BamHI-сайт, BamHI-фрагмент этой плазмиды, содержащий ген gpt, ввели в уникальный BamHI-сайт плазмиды BPV69T. В составе pBPV69T-SV2gpt(57-5) 69Т-фрагмент и фрагмент pSV2gpt находятся в одинаковой транскрипционной ориентации, а в составе pBPV69T-SV2gpt(57-l) —
в противоположной ориентации. Ц, 69Т-фрагмент; —, ДНК SV40;-------------,
pBR322.
504
Глава 8
В плазмидах pBPV69T-SV2gpt ген SV2gpt состыкован с 69Т-фрагментом BPV-1 в обеих возможных ориентациях [35] (рис. 4). Эти плазмиды индуцируют морфологическую трансформацию мышиных клеток С127 и сообщают им способность расти на селективных средах. В подавляющем большинстве трансформированных клеточных линий экспрессируются два фенотипических маркера. Клетки, отбираемые по BPV-индуцируемой фокальной трансформации, могут расти в присутствии микофеноло-вой кислоты и наоборот, клетки, селектируемые по устойчивости к кислоте, не подвержены контактному торможению и способны расти в мягком агаре. Высокая частота коэкспрессии свидетельствует о том, что функциональная связь между двумя генами сохраняется независимо от их взаимной ориентации.
Следует, однако, отметить, что как и в случае плазмид BPV-tk, селекция по экспрессии гена gpt не решает проблемы реорганизации и интеграции плазмид BPV-gpt, что делает эти плазмиды непригодными для использования в качестве челночных векторов.
3.2.3. Плазмиды BPV, устойчивые к неомицину
Ген пеот, локализованный в Тп5, обеспечивает устойчивость бактериальных клеток к канамицину, а в случае его функционирования под контролем эукариотического промотора, устойчивость клеток млекопитающих к аминогликозиду G418 [36]. Ген пеот, фланкированный эукариотическим промотором и сигналом терминации транскрипции, использовали в сочетании как с целым геномом BPV-1 [37, 38], так и с 69Т-фрагментом [39] (рис. 5).
В плазмиде pdBPV-MMTneo (342-12) ген пеог, фланкированный промотором гена металлотионеина 1 мыши [40] на 5'-конце и сигналами сплайсинга и терминации транскрипции в составе малого t-антигена SV40 [41] на З'-конце, введен в производную pdBPV-1 [25] (рис. 5А).
pCGBPV представляет собой космиду, содержащую область начала репликации ColEI и X cos-еайт, состыкованные с целым геномом BPV-1. Ген пеог поставлен под контроль сразу двух промоторов — эукариотического (гена tk HSV-1) и прокариотического (промотора PI из pBR322) [42] и, следовательно, может обеспечивать селекцию как в бактериальных клетках, так и в клетках млекопитающих. Сигналы полиаденилирования транскриптов локализованы на З'-конце гена tk HSV-1 (рис. 5Б).
Плазмида pV69 содержит аналогичную транскрипционную «кассету» с пеог, с той только разницей, что промотор PI заменен на гомологичный по отношению к пеот промотор из Тп5 [36]. В составе этой рекомбинантной конструкции ген пеот соединен с 69Т-фрагментом BPV-1 (рис. 5В).
Вирус бычьей папилломы: вектор для клонирования
505
Рис. 5. Рекомбинантные плазмиды BPV-1-neo. A. pdBPV-MMTneo содержит: фрагмент BamHl-Hindlll плазмиды pML2 (с инвертированной дупликацией •ЕсоШ-ЛтсНН-сегмента длиной 29 т.п.н.), несущий ген атрт и область начала репликации; сегмент EcoRl-Bglll с промотором мышиного гена металлотио-неина 1 [40]; сегмент Bglll-Xhol, включающий структурную часть гена пеог, в котором отсутствует сайт Sal\\ фрагмент SV40 (850 п. н.), несущий сигналы сплайсинга и З'-концевые сигналы терминации транскрипции малого t-антигена [41]; сегмент Ват\Л\-ВагпН\, включающий полный геном BPV-1. ¦, BPV-1;
1 —промотор ММТ; 2 — ген пеог; ?, SV40;------, pML2. Б. pCGBPV содержит:
сегмент, включающий область начала репликации ColEl и Kcos-сайт; промотор PI pBR322 [42]; промотор и сигналы полиаденилирования транскрипта tk HSV-1 [31], фланкирующие ген neorTh5; сегмент Hindlll-Hindlll, включающий полный геном BPV-1. В pCGBPV7 направление транскрипции гена пеох совпадает с направлением транскрипции ДНК BPV-1, а в pCGBPV9 их транскрипция происходит в противоположных направлениях. Ц, BPV-1; О, область начала репликации ColEl; ?, Xcos; 3 — промотор PI pBR322; 4 — промотор и сигналы полиаденилировния tk HSV-1. В. pV69 содержит: ген атрТ и область начала репликации pBR322; промотор пеог Тп5 Г36]; промотор и сигналы полиаденилирования транскрипта гена tkHSV-l, фланкирующие ген леог; 69Т-фрагмент BPV-1. Windlll-cafiT в ДНК BPV-1 конвертирован сайт BamHI. Стрелками показано направление транскрипции ДНК BPV-1 и гена пеоТ.
