Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
1363]. ДСН удаляют, либо осаждая белки охлажденным ацетоном [1379], либо хроматографией на анионообменниках [756, 1378], либо электродиализом [1317].
Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН по методу Вебера и Осборна [1379], Белки инкубируют в течение 2 ч при 37 °С в растворе, содержащем 0,01 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0), 1,% ДСН и 1% 2-меркаптоэтанола: если белки проявляют склонность к образованию агрегатов, то к ним добавляют 8 М мочевину. После инкубации белки диализуют в течение нескольких часов при комнатной температуре против 0,01М нат-рий-фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 0,1% ДСН и 0,1% 2-меркаптоэтанола. Электродный буфер: 0,1 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0), содержащий 0,1% ДСН. Состав геля: 10% Т, 2,65% С; 0,1 М натрий-фосфатный буфер (pH 7,0); 0,1% ДСН; 92 мг°/о персульфата аммония, 0,15 мл ТЕМЭД на 100 мл раствора. К каждой пробе добавляют 3 мкл 0,05%-ного раствора бромфенолового синего, 1 каплю глицерина и 5 мкл
2-меркаптоэтанола.
Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН по методу Леммли [732]. Пробы, содержащие 62,5 мМ буфер трис-НС1 (pH 6,8), 2% ДСН, 10% глицерина, 5% 2-меркаптоэтанола и 0,001% бромфенолового синего, погружают на 1,5 мин в кипящую воду. Концентрирующий гель: 3,08% Т, 2,6% С; 125 мМ трис-НС! (pH 6,8); 0,1% ДСН; 0,025% ТЕМЭД; 0,025% персульфата аммония. Разделяющий гель: 8,22%, Т и 2,6% С или
10,36% Т и 2,6% С; 0,375 М буфер трис-НС1 (pH 8,8); 0,1% ДСН, 0,025% ТЕМЭД, 0,025% персульфат аммония. Электродный буфер: 0,025М трис — 0,0192 М глицин (pH 8,3); 0,1% ДСН.
Приготовление полимеров белков по методу Вольфа и др. [1440]. 2 мг белка растворяют в 1 мл воды, добавляют 20 мкл диэтилпирокарбоната и перемешивают с максимальной скоростью на вихревом смесителе (Vortex) в течение 2—3 мин при комнатной температуре. Избыток диэтилпирокарбоната удаляют лиофилизацией или диализом против буфера, содержащего 0,01 М фосфат (pH 7,8), 1% ДСН и 1% 2-меркаптоэтанола.
Как следует из предыдущего обсуждения, эффективность электрофоретического разделения зависит от многих факторов, в том числе от суммарного заряда молекул, ситового эффекта используемого для электрофореза носителя, присутствия денатурирующих агентов и т. п. Благодаря такой вариабельности электрофорез обладает исключительно высокой разрешающей способностью. Однако при исследовании сложной смеси, состоящей из многих белков (а такие исследования приходится проводить довольно часто) некоторые белковые зоны могут перекрываться. В подобных случаях электрофорез во втором направлении может привести к более полному разделению анализируемых веществ, и этот принцип лежит в основе методов двухмерного электрофореза.
Электрофорез в первом направлении проводят обычным способом, а затем полученную электрофореграмму используют без фиксации и окрашивания в качестве стартовой зоны для электрофореза во втором направлении, перпендикулярном первому. Если оба этапа электрофореза осуществляют в идентичных условиях, то скорость миграции белков в обоих направлениях одинакова и зоны разделенных молекул располагаются по диагонали. Очевидно, что такие системы улучшают разделение лишь постольку, поскольку оно зависит от удлинения пути миграции разделяемых белков. Чтобы повысить разрешение в значительной степени, необходимо на втором этапе изменить по крайней мере один из электрофоретических параметров. В настоящей главе приводится краткое описание некоторых методов двухмерного электрофореза. Несколько дополнительных вариантов обсуждаются в главах, посвященных разделению определенных классов белков, в частности белков жидкостей тела, рибосом-ных и мембранных белков.
К числу первых разновидностей двухмерного электрофореза относится сочетание электрофореза на бумаге с электрофорезом в крахмальном геле. По этому методу после электрофореза на бумаге полоску электрофореграммы помещают в щель, вырезанную в крахмальном геле, и проводят электрофорез во втором направлении обычным способом [1031, 1203]. Применение
двухмерного электрофореза этого типа для разделения белков сыворотки крови человека не дало существенного увеличения числа разделенных фракций по сравнению с тем, что было получено с помощью одного электрофореза в крахмальном геле. Возможно, это объясняется низкой разрешающей способностью электрофореза на бумаге [720].
Крахмальный гель можно использовать при электрофорезе в обоих направлениях. Первое разделение проводят в крахмальном геле бдним из обычных способов, а затем блоки геля шириной 5 мм переносят на вторую пластину геля, причем последнюю лучше готовить на буфере, имеющем другое значение pH или содержащем денатурирующие агенты.
Очевидно, чем выше степень разрешения электрофоретических методов, применяемых в каждом направлении, тем эффективнее будет их комбинация. В связи с этим предпринимались многочисленные попытки использовать разносторонние возможности электрофореза в полиакриламидном геле для разделения сложных смесей белков. Помимо применения буферных растворов с разными значениями pH разработано множество методов, в которых для каждого направления используют гели, различающиеся по своим свойствам.
