Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Определение молекулярной массы гликопротеидов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН часто приводит к ошибочным результатам, поскольку содержащиеся в-, гликопротеидах полисахариды сильно влияют на способность этих макромолекул связывать ДСН [1163]. Кажущаяся молекулярная масса гликопротеидов снижается с увеличением концентрации геля ![345, 1163].
Аллисон и др. [26] показали, что некоторые аномалии в поведении белков при электрофорезе можно отнести за счет присутствия в геле ТЕМЭД, так как это соединение значительно уменьшает электрофоретическую подвижность белков с молекулярной массой ниже 20 000. Указанный эффект можно устранить путем предварительного пропускания тока через гель (пре-электрофореза).
ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКОВЫХ ЗОН ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ С ДСН
После электрофореза белковые зоны окрашивают кумасси ярким синим R-250 [367] или амидовым черным 10 В [964].
Ремазоловый яркий синий образует с белками ковалентную связь, благодаря чему белки становятся видимыми и за ними можно наблюдать в процессе электрофореза [480, 1243]. Существуют также реагенты, которые почти не влияют на молекулярную массу или заряд полипептидов и практически не изменяют подвижности белков в присутствии ДСН. Их можно использовать для очень чувствительного метода детектирования белковых зон. Так, например, в белки вводят флуоресцентную метку, применяя для этой цели дансилхлорид [1175, 1272] или о-фта-левый альдегид [1388].
Чувствительность детектирования белков можно повысить, если ввести в них радиоактивные изотопы. Для этого используют радиоактивный иод, а также меченные 14С иодацетамид, уксусный ангидрид [1170] или формальдегид [1084]. Некоторые из перечисленных соединений применяют для изучения топографии мембранных или рибосомных белков [265, 1003]. В зависимости от удельной активности реагентов метод позволяет обнаруживать 0,1 —1,0 мкг белка.
Визуальное обнаружение ДСН-белковых комплексов можно также осуществить путем охлаждения геля [1368]. После электрофореза цилиндрические столбики геля помещают в небольшие стеклянные пробирки с завинчивающимися пробками, а пластины геля — на стеклянные пластинки. Пробирки плотно завинчивают, а пластины геля покрывают слоем пленки morach vyno wrap и помещают на измельченный лед или в холодильник с температурой около 4°С. Через 3—5 ч белковые зоны проявляются в виде белых мутных участков. По всей вероятности, ДСН-белковые мицеллы служат центрами конденсации значительных количеств ДСН. Чувствительность метода составляет t),2 мкг овальбумина на 1 мм2.
При окрашивании и обесцвечивании гели набухают, а краситель, маркирующий фронт (обычно бромфеноловый синий), вызывается; поэтому значение Ri для белков следует рассчиты-
вать по формуле Вебера и Осборна [1379]
Расстояние, пройденное белком Длина геля до окрашивания = Длина геля после окрашивания ’ Расстояние, пройденное красителем *
Помимо разделения белков по молекулярной массе электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН дает высокое разрешение и облегчает разрезание геля, поскольку ДСН при охлаждении выпадает в осадок и препятствует образованию крупных кристаллов льда.
ДСН переводит в растворимую форму большинство белков, которые нельзя солюбилизировать другими методами .[896], а также белки, осажденные ТХУ с целью их концентрирования [801] (избыток ТХУ удаляют ацетоном).
Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН позволяет быстро различить характер протеинурии (клубочковый или канальцевый) ,[989] по молекулярной массе выделяющихся белков.
Кроме того, описанный метод широко используется при изучении биосинтеза и иммунологических свойств белков. В этих случаях белки осаждают специфическими антителами, осадок растворяют в присутствии ДСН и затем анализируют методом электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем ДСН. Такой способ позволяет легко очистить белки за счет их антигенных свойств; диссоциирующие при электрофорезе легкие и тяжелые цепи антител могут служить внутренними стандартами молекулярной массы [197, 423, 959, 1466].
Под действием ДСН большинство биологически активных белков инактивируется, но некоторые белки, например глюко-зооксидаза, полностью сохраняют свою активность, а папаин и пепсин инактивируются лишь частично ([911]. Ряд катаболиче-ских ферментов также могут оставаться активными в присутствии ДСН [599, 1035], и, чтобы инактивировать эти ферменты, их образцы с ДСН следует кипятить в течение нескольких минут.
Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН можно проводить как в однородных, так и неоднородных буферных системах [325, 756, 1171, 1379], в которых концентрирование белков происходит в результате изотахофореза [732, 922].
Молекулярную массу белков определяют также при электрофорезе в градиентах полиакриламидного геля, содержащего ДСН [34, 146]. Гейнер [419] применил микроэлектрофорез в полиакриламидном геле с ДСН для изучения биосинтеза белков в отдельных нейронах.
Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН можно также использовать для препаративного выделения белков [1423,
