Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
По этой причине рекомендуется перед электрофорезом б гелях с ДСН проводить восстановление белков.
С другой стороны, белки, состоящие из нескольких полипептид-ных цепей, диссоциируют под действием ДСН с образованием одиночных полипептидных цепей [331, 911, 1118]. ДСН-белко-вые комплексы находятся в развернутой конформации и имеют форму жесткого стержня [1082]. Радиус Стокса для белков зависит в этом случае от молекулярной массы [382], вследствие чего подвижность белков находится в линейной зависимости от логарифма их молекулярной массы.
Если белки свяжут менее 1,4 г ДСН на 1 г белка, то они не будут иметь формы жесткого стержня и их подвижность в гелях с ДСН будет зависеть не только от молекулярной массы [1138]. Более того, так как белки образуют очень непрочные комплексы с ДСН, между свободными и связанными молекулами детергента происходит быстрый обмен [1170], и электрофоретическая подвижность комплекса становится независимой от концентрации ДСН лишь в том случае, если последняя составляет около 0,1% [[664]. Таким образом, ДСН должен обязательно присутствовать в геле, и обычно его используют в концентрации 0,1%.
На основании опубликованных в настоящее время данных можно сделать вывод, что ДСН устраняет, по-видимому, разли-
Рис. 78. Зависимость логарифмов относительных подвижностей ДСН-белковых комплексов от концентрации мономеров в геле [921]. 3 — миозин; 4 — р-галак-тозидаза; 5 — фосфорилаза А; 6 — БСА; 7 — каталаза; 8 — овальбумин; 9 — ДНКаза I; 11 — химотрипсиноген; 12 — трипсиндиизопропилфторфосфат; 16 — гемоглобин.
'чия между белками, связанные с их зарядом, и переводит молекулы белков в конформацию, при которой радиус Стокса является функцией молекулярной массы. Если эти два условия не выполняются, подвижность белков не будет отражать их молекулярные массы. Белки, несущие очень большой заряд, такие, как гистоны [964], полилизилглутаминовая кислота {1013], *ферредоксины [1425] или малеилированные белки [85, 1267, ¦1311, 1312], при электрофорезе в полиакриламидном геле с ДСН обнаруживают аномальное поведение. Если белки после ком-плексирования с ДСН не приобретают форму жесткого стержня ^(например, коллаген [413]) или если это белки с низкой молекулярной массой (когда молекулы имеют скорее сферическую, :а не палочковидную форму), определение молекулярной массы с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН может давать ошибочные результаты. Такие аномалии нередко удается обнаружить, построив график зависимости lg Rt от Кг 1324. 922].
Построение калибровочных кривых. Калибровочную кривую, необходимую для определения молекулярной массы белков, можно получить путем электрофореза нескольких чистых белков с известной молекулярной массой. Однако далеко не в каждой лаборатории имеется набор таких белков. В этом случае калибровочную кривую можно построить с помощью одного единственного белка, если получить его полимеры, используя «сшивающие агенты, подобные диэтилпирокарбонату [760, 1440, 1441] или диметилсуберимидату [195, 781]. Образованные таким способом полимеры, содержащие 5—10 мономеров, позволяют проводить определение молекулярных масс в широком диапазоне (рис. 79). Наличие полимеров высокомолекулярного белка дает возможность построить калибровочную кривую для белков с мол. массой до 600 000 (рис. 80).
Точность определения молекулярной массы белков выше 10 000 описанным методом составляет около 5%, причем полученные величины довольно хорошо согласуются с результатами, которые дают другие методы [291]. Данный метод имеет особенно большое преимущество в тех случаях, когда по каким-либо причинам нельзя применять иные способы определения молекулярной массы, например при образовании белковых агрегатов i[263].
Источники ошибок. Если молекулярная масса белка составляет менее 10 000, ее определение методом электрофореза с ДСН может привести к существенным ошибкам, обусловленным конформацией ДСН-белковых комплексов. По данным Свэнка и Манкруса [1267], эти ошибки можно в значительной степени устранить, повысив отношение акриламид: бас-акриламид до 10: 1 или добавив в гель -8 М мочевину.
Рис. 7Р. Калибровочные кривые для определения молекулярных масс белков методом электрофореза в 10%-ном (/) и 12,5%-ном (//) полиакриламидном геле, содержащем ДСН [414]. Полимер РНКазы был получен при помощи диэтилпирокарбоната по методу Вольфа и др. [1441].
Рис. 80. Молекулярные массы белков саркоплазм этического ретикулума, обработанных диметилсуберимидатом. Белки мигрировали в смешанном геле, состоящем из 0,5%-ной агарозы и 2%-ного полиакриламида и содержащем 0,1% ДСН [781]. О белки сар-коплазматических пузырьков; Л полимеры белка А.
Как уже отмечалось, определение молекулярной массы белков, обладающих чрезвычайно большим зарядом или находящихся в необычной конформации, также дает ошибочные результаты. Однако подобные ошибки можно исправить с помощью калибровочных кривых для белков с известной молекулярной массой, имеющих такие же конформационные характеристики или заряды, как и изучаемые белки [413, 964]. Для определения молекулярной массы сильно кислых белков (например, ферредоксинов) вместо ДСН используют катионные детергенты (бромистый [1425] или хлористый цетилпиридиний; [ИЗО]).
