Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
тин); 16 — уреаза, 17 — рибулозодифосфат-карбоксилаза.
Рис. 76. Зависимость между логарифмом молекулярной массы и отношением абсолютных подвижностей белков при двух разных концентрациях геля (/ — 8 и 5,0%; //— 10 и 5%). Для каждой концентрации геля даны средние величины из трех определений [1483]. / — овальбумин куриного яйца; 2 — гемоглобин А человека; 3 — сывороточный альбумин человека; 4 — трансферрин человека; 5 — гаптоглобин человека; 6 — лактатдегидрогеназа человека; 7 — мономер БСА;
8 — димер БСА; Р —тример БСА; 10—тетрамер БСА.
скольких субъединиц. Недостаток этих методов заключается в том, что результаты сильно зависят от конформации белков, поэтому приходится проводить большое число экспериментов.
Для устранения конформационных различий между белками Торан и Мел [129] предложили использовать смесь фенол — уксусная кислота — вода (2:1:1), в которой белки приобретают конформацию статистического клубка.
Пул и др. [1019] применяли для определения молекулярной массы полипептидов 10%-ный полиакриламидный гель, содержащий 8 М мочевину и 0,9 М уксусную кислоту. Точность определения составляла 15%. Хотя этот метод менее чувствителен, чем описанный ниже электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН, он позволяет определять молекулярные массы, лежащие ниже 15000, а в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле, содержащем ДСН, дает возможность разделять полипептидные цепи, имеющие одинаковые размеры, но разные заряды.
Для определения молекулярной массы применяют также электрофорез в гелях с градиентом пористости [39, 372, 706]. Согласно данным Андерссона и др. [39], при использовании линейного градиента концентрации геля (4—26%) в отсутствие мочевины можно определять молекулярные массы белков от 50 000 и выше, а в присутствии 8 М мочевины этот предел может быть снижен до 20 000.
Методы второй группы позволяют снизить влияние заряда на электрофоретическую подвижность белков до такой степени, что их миграция в полиакриламидном геле зависит только от размеров молекул.
В 1966 г. Майзель сообщил о том, что в присутствии анионного детергента ДСН мембранные белки можно легко солюбилизировать и разделить путем электрофореза в полиакриламидном геле. Позднее Шапиро и др. [1171] показали, что подвижность белков, связанных с ДСН, зависит от их молекулярной массы. Отношение между расстоянием х, пройденным белком, и его молекулярной массой может быть выражено следующим уравнением:
Молекулярная масса = k¦ КН*, (1)
где k — константа, а Ъ — наклон кривой.
Вебер и Осборн {1379] обнаружили, что при электрофорезе в 10%-ном полиакриламидном геле, содержащем 0,1% ДСН, для белков с мол. массой 10 000—70 000 существует линейная зависимость между логарифмом молекулярной массы и электрофоретической подвижностью белков. Для белков смол, массой порядка 50 000—200 000 эта зависимость выражается кривой, имеющей слегка гиперболическую форму. Другие авторы [325]
Рис. 77. Зависимость логарифмов молекулярных масс белков от их относительных подвижностей в полиакриламидных гелях разных концентраций, содержащих 0,1 % ДСН [325]. А. 5%-ный гель. Б. 10%-ный гель. В. 15%-ный гель. У — пентамер БСА; 2 — тетрамер БСА; 3 — тример БСА; 4 — у-гл°6улин; 5 — димер БСА; 6 — БСА; 7—овальбумин; 8 — пепсин; 9 — карбоксипелтидаза; 10 — химотрипси-ноген А; И— трипсин; 12 — вирус мозаики костра; 13 — р-лактоглобулин; 14 — миоглобин; 15—белок вируса табачной мозаики; 16 — лизоцим; 17 — Р-оксиметиллизоцим; 18 — РНКаза А; 19 — ацетилцистаминил-РНКаза А; 20 — В-цепь химотрипсина; 21 — белок вируса R17; 22—цитохром С; 23—С-цепь химотрипсина; 24 — инсулин.
применили полиакриламидный гель в концентрациях 5, 10 и 15% для определения молекулярных масс белков, равных соответственно 20 ООО—350 000, 10 000— 100 000 и 10 000—60 000 (рис. 77). В указанных пределах калибровочные кривые представляют собой прямые линии, за исключением кривой для белков с мол. массой ниже 20 000, которые мигрируют медленнее, чем можно было бы ожидать, исходя только из их молекулярной массы (рис. 77, Л). Интересно отметить, что точки, соответствующие подвижности инсулина (мол. масса 57 00), при всех концентрациях геля лежат ниже соответствующих калибровочных кривых.
ТЕОРИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ С ДСН
Если подвижность ДСН-белковых комплексов нанести на график как функцию концентрации акриламида (Г, %), то получаются прямые, имеющие разные значения Кт9 но пересекающиеся с ординатой приблизительно в одной точке (рис. 78) |[85, 922]. Это позволяет предположить, что у всех белков в комплексе с ДСН отношение заряда к массе имеет одно и то же
значение, а отношение эффективного заряда iK коэффициенту трения не зависит от молекулярной массы.
Иными словами, крупная молекула обладает такой же свободной подвижностью, как ее фрагмент или менее крупная молекула.
Установлено [1013, 1082], что различные белки связывают практически одинаковые количества ДСН на единицу массы (1,39—1,42 г ДСН на 1 г белка). Белки, содержащие дисульфидные мостики, связывают меньше ДСН, чем те белки, которые их не содержат, но это различие устраняется при восстановлении дисуль-фидных мостиков [1013].
