Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 88

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 82 83 84 85 86 87 < 88 > 89 90 91 92 93 94 .. 185 >> Следующая

Основные принципы двухмерного электрофореза в полиакриламидном геле были сформулированы Раймондом [1062]. Он показал, что электрофорез на пластинах полиакриламидного геля в двух направлениях (ортакрильная методика — от англ. orthogonal и acrylamide) позволяет получить информацию о распределении сходных белков по зарядам и размерам.
Если концентрация полиакриламидного геля во втором направлении выше, чем в первом, а значения pH одинаковы, то скорость миграции всех компонентов данного размера будет изменяться одинаково, и в результате эти белки будут располагаться на прямой, проходящей через старт.
Если же при электрофорезе во втором направлении применяют буферную систему с другим pH, то наблюдается иная электрофоретическая картина. В этом случае на разделение влияют изменения в характере диссоциации определенных групп белковой молекулы. Все белки с идентичными кривыми титрования будут располагаться на прямой, проходящей через точку нанесения пробы, а компоненты с другими кривыми титрования будут находиться вне этой линии. На практике следует менять и буферную систему, и концентрацию геля.
Возможность для дальнейшего улучшения разделения белков открывает сочетание изоэлектрического фокусирования с электрофорезом в полиакриламидном геле, содержащем ДСН, а также использование различных видов равномерных или скачкообразных градиентов концентрации полиакриламида.
Поскольку все указанные методы можно сочетать друг с дру-гом, число возможных вариантов двухмерного электрофореза огромно. На практике же число этих комбинациЗ несколько ограниченно, так как изоэлектрофокусирование применяют только в первом направлении (отчасти это обусловлено высокой стоимостью амфолитов-носителей), а ДСН-содержащие гели — только на второй стадии электрофореза из-за трудностей, связанных с удалением ДСН из комплексов с белками. В зависимости от изменений, вводимых при электрофорезе во втором направлении,, можно выделить следующие типы двухмерного электрофореза:
1) двухмерный электрофорез без изменения pH;
2) двухмерный электрофорез с изменением pH;
3) диск-электрофорез с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле, содержащем ДСН;
4) изоэлектрофокусирование с последующим электрофорезом;
5) изоэлектрофокусирование с последующим электрофорезом в полиакриламидном геле, содержащем ДСН.
ДВУХМЕРНЫЙ электрофорез БЕЗ ИЗМЕНЕНИЯ pH
В данном методе используют эффект молекулярного сита, свойственный полиакриламидным гелям различной концентрации. Чтобы улучшить разрешение, рекомендуется на первом этапе проводить электрофорез в геле с низкой концентрацией полиакриламида, а на втором — электрофорез в градиенте концентрации полиакриламида. Такие системы были применены при разделении белков сыворотки крови [821, 1452]. Марголис и Кенрик |821] для электрофореза в первом направлении использовали 2,7%-ный гель, а Райт [1452]—4,75%-ный. Электрофорез во втором направлении проводили в градиенте концентрации 4—20%-ного 1[821] или 2—30%-ного [1452] полиакриламида. Применение в первом направлении 2,7%-ного полиакриламидного геля [821] улучшало разделение белков с большой молекулярной массой, тогда как при электрофорезе во втором направлении разделение было лучше при использовании более крутого градиента :[1452]. Об эффективности указанных методов свидетельствует то, что при разделении с их помощью белков сыворотки человека на электрофореграмме было обнаружено более ста зон [1452].
В обоих описанных выше методах электрофорез в первом направлении проводили в цилиндрических гелях, а во втором — на пластинах геля. Чтобы предотвратить смешивание разделенных белковых зон в тот момент, когда они в процессе электрофореза выходят из первого геля и проникают во второй, пространство между этими двумя гелями также должно быть заполнено ге-
лем. Один из способов его заполнения состоит в том, что столбик первого геля помещают в кювету для формирования второго геля, наливают в нее гелеобразующий раствор и дают ему заполимеризоваться. По другому способу полимеризацию пластин геля проводят уже во время электрофореза в первом направлении. В этом случае на готовую пластину геля наливают сверху свежий гелеобразующий раствор и погружают в него столбик первого геля. Когда для этой цели используют полиакриламид, 'то, чтобы уменьшить возможность образования артефактов, проводят, как правило, фотополимеризацию. Существует также простой и быстрый способ заполнения пространства между гелями расплавленной агарозой [975]. Преимущество этого способа заключается в том, что благодаря быстрому застыванию агарозного геля сокращается время операции и уменьшается степень расширения разделенных зон в результате диффузии.
Был описан также метод двухмерного электрофореза, осуществляемого в обоих направлениях на одной пластине геля, Вейн [1391] проводил такой электрофорез в сигмоидном вогнутом градиенте концентрации полиакриламидного геля. Для его формирования использовали квадратную ячейку, в которую гелеобразующий раствор наливали с одного угла этой ячейки. В противоположный угол наносили образец и затем проводили электрофоретическое разделение в двух перпендикулярных направлениях.
Предыдущая << 1 .. 82 83 84 85 86 87 < 88 > 89 90 91 92 93 94 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed