Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Белки, содержащие медь, выявляют с помощью реакции с ализариновым синим S ;[ 1327]. Электрофореграмму погружают на 30 мин в раствор, приготовленный перед употреблением из
1 части насыщенного раствора ализариного синего S в концентрированной уксусной кислоте и 9 частей 70%-ной уксусной кислоты; затем ее промывают 70%-ной уксусной кислотой. Появление синих полос служит специфическим показателем присутствия в белке меди. Другой метод обнаружения медьсодержащих белков описали Рид и др. [1068]. Гели помещали на 3 ч в
0,2 М раствор цистеина, а затем — в 0,1%-ный раствор 2,2'-бис-хинолина в ледяной уксусной кислоте. Белки, содержащие медь, окрашивались в красный цвет.
Гликопротеиды можно выявить путем окрашивания как белковой, так и углеводной части молекулы. Для обнаружения гликопротеидов после электрофореза используют такие белковые красители, как амидовый черный 10 В 14731, быстрый зеленый {883] или кумасси яркий синий R-250 [839]. Методы, основанные на реакциях углеводной части молекулы, обсуждаются в последующих разделах.
Захариус и др. [1477] предложили метод с применением йодной кислоты и реактива Шиффа. В присутствии ДСН некоторые белки, не содержащие углеводов, также выявляются данным методом. [442, 1163]. Поэтому была предложена модифицированная методика, позволяющая проводить специфическое окрашивание гликопротеидов даже в присутствии ДСН ;[ 1163].
Полиакриламидные гели фиксируют в течение ночи в 40%-ном водном этаноле, содержащем 5% ледяной уксусной кислоты. Затем гели погружают на 2—3 ч в 0,7%-ный раствор йодной кислоты в 5%-ной уксусной кислоте. После этой обработки гели вымачивают в течение 2—3 ч в 0,2%-ном растворе метабисульфита натрия в 5%-ной уксусной кислоте с однократной сменой этого раствора после первых 30 мин. Наконец, гели помещают в пробирки, заполненные реактивом Шиффа. При комнатной температуре окраска развивается в течение 12—18 ч. Реактив Шиффа готовят следующим образом: 10 г основного фуксина растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды. После охлаждения к раствору добавляют 200 мл 1 н. НС1 и 17 г метабисульфита натрия и перемешивают до исчезновения окраски. Затем раствор встряхивают с активированным углем, промытым НС1, и удаляют уголь путем центрифугирования. Чтобы очистить надосадочную жидкость от следов угля, ее фильтруют через стеклянную вату. (Следует избегать контакта
раствора с фильтровальной бумагой.) Фильтрат должен быть прозрачным и бесцветным. Реактив можно хранить в темной посуде при 4°С.
Описанный выше метод был модифицирован [833]. Согласно этой модификации, гели оставляют в реактиве Шиффа на 18 ч для достижения максимальной интенсивности окраски, а затем переносят в 0,2%-ный раствор метабисульфата калия в 5%-ной уксусной Кислоте. При такой обработке интенсивность окраски быстро нарастает в течение первых 2 ч и более медленно на протяжении последующих 8 ч. Модифицированный метод имеет в два раза более высокую чувствительность, чем исходный. Полосы можно сканировать при 520 нм. Между площадью пиков и количеством нанесенных гликопротеидов наблюдается линейная зависимость, но кривые для разных гликопротеидов имеют неодинаковый наклон. Поэтому очень важно использовать для количественной оценки гликопротеида соответствующую калибровочную кривую.
Гликопротеиды можно также окрашивать алциановым синим. Гели фисируют в течение 30 мин в 12,5%-ной ТХУ, ополаскивают дистиллированной водой и помещают на 50 мин в 1%-ный раствор йодной кислоты в 5%-ной уксусной кислоте. Избыток перйодата удаляют, промывая гели несколько раз дистиллированной водой. Затем их погружают на 30 мин в 0,5%-ный раствор метабисульфита натрия, опять промывают дистиллированной водой и помещают в водный раствор, содержащий 0,5% алцианового синего и 3% уксусной кислоты. Через 4 ч фон обесцвечивают 7%-ной уксусной кислотой [1374].
Описанные в настоящей главе методы можно использовать для обнаружения, а в некоторых случаях и для количественного определения белков после их разделения с помощью электрофореза в средах, содержащих обычные буферные растворы. В присутствии высоких концентраций таких добавочных агентов, как ДСН или мочевина, следует уделять особое внимание правильной фиксации белков. Амфолиты-носители, применяемые при изоэлектрофокусировании, создают дополнительные трудности, так как образуют со многими белковыми красителями нерастворимые комплексы. Поэтому при наличии в растворах указанных добавок необходимо применять модифицированные методы окрашивания. Некоторые примеры окрашивания белков после электрофореза в присутствии ДСН или амфолитов-носителей приведены в главах, посвященных соответствующим методам разделения.
11.6. Обнаружение белков
по их ферментативной активности
Для выявления ферментов, содержащихся в сложной смеси белков, подвергнутых разделению, можно использовать реакции, которые катализируют эти ферменты. Преимущество таких способов локализации состоит в том, что они являются не только более специфическими, но и значительно более чувствительными, чем обычные методы окрашивания белков.
