Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Грегори и Фридович ;[474] разработали для обнаружения каталазы метод отрицательного окрашивания. В течение 45 мин гели выдерживали в темноте при 23 СС в смеси, состоявшей из
2 мл 0,05 М калий-фосфатного буфера, pH 7,0, 0,25 мл З.З'-ди-аминобензидина (4 мг/мл) и 0,1 мл пероксидазы хрена (1 мг/ /мл). После инкубации гели дважды промывали водой и помещали в раствор 0,02 М Нг02 в 0,05 М калий-фосфатном буфере, PH 7,0. На положение фермента в геле указывали бесцветные полосы.
Многие ферменты, образующие перекись водорода, обнаруживают, используя пероксидазы в качестве вспомогательных ферментов. Для выявления сульфитоксидазы полиакриламидные гели инкубируют в смеси, содержащей 2 мл 0,1 М трис-НС1 (pH 8,5) с 0,1 мМ ЭДТА, 0,25 мл З^'-диаминобензидинтетра-хлорида (4 мг/мл) и 0,1 мл пероксидазы хрена (1 мг/мл). Реакцию начинают, добавляя к этой смеси субстрат (0,1 мл 0,1 М бисульфита формальдегида). При использовании соответствующих субстратов и буферных растворов данный метод пригоден также для обнаружения глюкозооксидазы, оксидаз D- и L-ами-нокислот, альдегидоксидазы, ксантиноксидазы и салицилатгид-роксилазы [239]. Описана модификация этого метода, позволяющая обнаруживать моноаминоксидазу [583],
Для гистохимического выявления оксидаз был предложен З-амино-9-этилкарбазол в качестве хромогена, подвергающегося перекисному окислению. [462]. Впоследствии было показано, что этот субстрат можно использовать для идентификации ряда пе-роксидаз после электрофореза в крахмальном [1105] и полиакриламидном [368] гелях.
Методы другого типа, предназначенные для обнаружения оксидаз, основаны на переносе электронов с восстановленной флавиновой части некоторых ферментов сначала на ФМС, а затем на соль тетразолия [14]. Так, например, изоферменты мо-ноаминоксидазы локализовали путем инкубации электрофореграмм, полученных на ацетате целлюлозы, в смеси, содержавшей 2 мл 0,2 М субстрата (тирамин, бензиламин или изоамил-амин), 2 мл 5мМ MgCb, 5 мл 0,5 М фосфатного буфера (pH 7,4), 5 мл НТС (1 мг/мл), 2 мл 0,01 М NaCN, 0,5 мл ФМС (1 мг/мл) и 2 мл семикарбазида. Для количественного определения изоферментов вырезали окрашенные участки электрофореграмм, элюировали из них хромоген и определяли его количество фотометрическим методом [675].
В некоторых методиках ФМС не включают в реакционную среду. Так, Юдим и др. [1472] для обнаружения моноаминок-сидазы инкубировали гели в 5 мл фосфатного буфера (pH 7,4), содержавшего 4 мг НТС, 1 мг Na2S04 и 4 мг хлорида трипта-мина. Модификация этого метода, в которой моноаминоксидаза играет роль вспомогательного фермента, может быть использована для обнаружения декарбоксилаз ароматических аминокислот [45].
Фейнштейн и Линдал [368] провели сравнение двух методов, пригодных для выявления оксидаз L-аминокислот, уратов, диаминов, оксикислот и альдегидов: пероксидазного метода, в котором роль хромогена выполняет З-амино-9-этилкарбазол, и метода, в котором используют реакцию с участием ФВС и соли тетразолия. Реакционные смеси имели следующий состав:
1) 4 мл 0,1 М фосфатного буфера, pH 8,0 + 1 мл воды+1 мл 0,01 М раствора субстрата +1 мл пероксидазы (1 мг/мл; неочищенный препарат фирмы Sigma)+ 1 мл З-амино-9-этилкарба-
зола;
2) 4 мл Vis М фосфатного буфера, pH 6,8+2 мл воды +1 мл 0,01 М раствора субстрата +0,5 мл НТС (1 мг/мл) +0,5 мл ФМС (0,5 мг/мл).
Очевидно, что первый метод является специфическим для оксидаз, так как он основан на образовании перекиси водорода. Во втором методе механизм реакции менее изучен, но сам метод обладает более высокой чувствительностью.
Поскольку в основе обычных методов определения дегидрогеназ также лежит образование формазанов, следует проверять, образуются ли эти соединения в отсутствие NAD.
Для обнаружения супероксиддисмутазы была использована реакция НТС с 02 [96]. Вначале гели выдерживали 20 мин в 2,45-10_3 М растворе НТС, а затем погружали на 15 мин в раствор, содержавший 28 мМ ТЕМЭД, 0,028 мМ рибофлавин и 36 мМ калий-фосфатный буфер, pH 7,8. Далее гели помещали в сухие пробирки и оставляли на свету на 5—10 мин; в результате гели приобретали синюю окраску, за исключением зон, содержавших супероксиддисмутазную активность, которые оставались бесцветными.
Изоферменты липоксигеназы можно выявить после электрофореза на ацетате целлюлозы, инкубируя электрофореграммы в течение 20 мин в 7,5 мМ растворе линолевой кислоты в 0,25%-ном растворе детергента твин 20, забуференном 0,2 М фосфатом до pH 6,5. После инкубации электрофореграммы промывают дистиллированной водой и погружают на 30 с в 5%-ный раствор Fe(iNH4)2(S04)2 в 3%-ной НС1, а затем еще на 30 с в 20%-ный раствор (NHUJSCN. В местах расположения фермента появляются красновато-коричневые пятна S[487].
11.6.3. Редуктазы
Нитриты, образующиеся под действием нитратредуктазы, можно обнаружить с помощью реакции азосочетания. Ингл [610] инкубировал полиакриламидные гели при 30 °С в присутствии нитрата, М-(1-нафтил)-этилендиаминхлорида, сульфаниламида и NADH. После окончания инкубации гели переносили в 0,1 М НС1. Образующийся в этих условиях диазокраситель диффундирует из геля, поэтому энзимограммы следует сканировать сразу же после развития окраски.
