Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
П.4.6. Способы усиления преципитации
при электроиммуноанализе и перекрестном иммуноэлектрофорезе
Для выявления малых количеств антигена следует применять сильно разведенные антисыворотки. Однако при слишком сильном разведении образуются очень бледные преципитаты, которые трудно обнаружить. Чувствительность реакции преципитации можно повысить, если применять более чувствительные красители для белка, такие, как кумасси яркий синий. Можно использовать также реакцию с серебром [671]. Описанные в литературе способы выявления антигенов основаны на иммунохи-мических и физико-химических принципах. Кроме того, приме-
няют антигены и антитела, меченные радиоактивными изотопами.
Простейший способ усиления преципитации состоит в том, что после завершения электроиммуноанализа пластинки оставляют на некоторое время во влажной камере. Усиление преципитации в данном случае объясняют существованием в зоне преципитата ненасыщенных антигенных валентностей, которые могут связывать добавочное количество антител :[514]. Используя этот принцип, Киндмарк и Торелл [677] наслаивали на гель раствор антител, меченных I2SI, и обнаруживали пики преципитации с помощью радиоавтографии (электроиммуноанализ сначала проводили в геле с немеченными антителами). При таком способе чувствительность обнаружения С-реактивного белка в плазме человека повышалась в 60 раз.
Другой иммунохимический прием заключается в том, что на гель наносят антитела, направленные против тех антител, которые используются при первом электроиммуноанализе. Избыток первых антител удаляют промыванием и на гель наслаивают раствор вторых антител. Таким методом Дарси i[274], в частности, анализировал карциноэмбриональный антиген. С целью дальнейшего увеличения чувствительности этого приема вторые антитела можно пометить радиоактивным иодом. Киндмарк и Торелл [677] нашли, что метод с использованием меченых вторых антител является менее чувствительным, чем их собственный метод (см. выше).
Саравис и Бонакер :[ 1121] обнаруживали растворимые иммунные комплексы с помощью реакции связывания комплемента. После проведения электроиммуноанализа на пленке из ацетата целлюлозы ее обрабатывали сывороткой морокой
овинки без 'предварительного вымачивания в солевом растворе. После реакции связывания комплемента непреципи-тированные белки удаляли и для дальнейшего усиления иммунной реакции пленку пропитывали антисывороткой к белкам сыворотки морской
свинки. Смысл такой обработки заключается в том, что
первый компонент системы
комплемента вызывает преципитацию тех иммунных комплексов, которые в противном случае остаются растворимыми.
Гель,
— содержащий антитело
Гель,
^____содержащий
очищенный
меченый
антиген
Рис. 95. Схематическое изображение электроиммунного анализа по методу Нёргарда-Педерсена [932], в котором для повышения чувствительности используют очищенный меченый антиген.
Была разработана методика [932] с применением меченого антигена (рис. 95), напоминающая ракетно-линейный иммуноэлектрофорез Г719]. При исследовании а-фетопротеина нижний предел чувствительности составлял 20 нг/мл. Меченый антиген наносили на узкую полоску геля на его катодном конце, остальной гель содержал антитела. Лунки для образцов вырезали на границе этих двух участков геля.
Широко распространенным способом повышения чувствительности иммунопреципитации является добавление к агаровому или агарозному гелю декстрана или полиэтиленгликоля. Хис-лоп [604] изучал влияние на преципитацию белков декстранов с различными молекулярными массами. Наилучи1ие результаты были получены с декстранами Т150 и Т500. Костнер и Хала-сек [712] исследовали эффективность декстрана Т70 и полиэтиленгликоля (мол. масса 6000) при электроиммуноанализе и перекрестном иммуноэлектрофорезе. Они нашли, что оба полимера обладают одинаковой эффективностью и повышают чувствительность метода в 5 раз при использовании их в оптимальной концентрации (4 г/100 мл).
II.5. Окрашивание белков на электрофореграммах
Белки после электрофореза чаще всего выявляют, окрашивая электрофореграммы теми или иными красителями. Общие принципы методов окрашивания приведены в разд. 1.15.2, а здесь будут рассмотрены лишь некоторые белковые красители и отдельные примеры их применения.
Пожалуй, наиболее широко для окрашивания белков используют амидовый черный 10 В (современные фирменные названия: нафталиновый черный 12 В 200, нафталовый сине-черный б В, буффало черный, понтациловый сине-черный SC или SX, С. I. 20,470). Этот краситель применяют для окрашивания белков после электрофореза на бумаге или в различных гелях. Его обычно растворяют в 7%-ной уксусной кислоте или в смеси уксусной кислоты, метанола и воды. В обоих случаях раствор перед употреблением обязательно следует профильтровать, поскольку крупинки нерастворившегося красителя могут давать ложное окрашивание.
