Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Очень простую методику окрашивания белков с помощью кумасси яркого синего G-250 описали Рейзнер и др. [1073J. Для приготовления красящего раствора водный раствор красителя и хлорную ишслоту смешивают между собой до их конеч-
ной концентрации 0,04 и 3,5% (масса/объем) соответственно; Смесь перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре и фильтруют сначала через бумагу ватман № 1, а затем через миллипоровый фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный раствор можно хранить при комнатной температуре. При окрашивании гели погружают в этот раствор на 45 мин при 37 °С или не менее чем на 90 мин при комнатной температуре. Белки проявляются в виде голубых полос на бледном фоне. Обесцвечивать фол не требуется, поскольку в присутствии хлорной кислоты краситель, не связанный с белком, бесцветен, тогда как краситель, связанный с белком, имеет голубой цвет. При использовании данного метода следует помнить, что некоторые белки (например, богатые лизином гистоны) растворимы в хлорной кислоте и поэтому могут вымываться из геля.
Кумасси яркий синий не проявляет строгой специфичности по отношению к белкам. В определенных условиях он может окрашивать также фосфолипиды ,[196].
Для окрашивания белков часто применяют кислотно-основный индикатор бромфеноловый синий. Так как в условиях электрофореза этот краситель непрочно связывается с белками, его часто используют в качестве окрашенного маркера при электрофорезе в полиакриламидном геле в щелочных системах. Кун-кель и Тизелиус [728] применяли для окрашивания белков после электрофореза на бумаге водный раствор, содержавший 1% хлористой ртути, 0,05% бромфенолового синего и 2% уксусной кислоты.
Обесцвечивание фона можно проводить путем четырехкратного промывания гелей 0,05%-ной уксусной кислотой. Другие авторы {478] применяли для окрашивания белков после изотахофореза раствор, содержащий 50 мг хлористой ртути и 0,5 г бромфенолового синего в 500 мл 50%-ного водного этанола. Для обесцвечивания гели вымачивали в 30%-ном этаноле и 5%-ной уксусной кислоте [478].
Для обнаружения белков после электрофореза на бумаге используют также раствор бромфенолового синего, к которому добавлен ZnS04. Полоски электрофореграмм помещают в водный раствор, содержащий 0,01% (масса/объем) бромфенолового синего, 5% (объем/объем) уксусной кислоты и 5% (масса/объем) ZnS04, и оставляют в нем на 16 ч при комнатной температуре. Затем полоски многократно промывают 2%-ной уксусной кислотой и погружают на 2 мин в раствор 2%-ного ацетата натрия и 10%-ной уксусной кислоты. После этого полоски прома-кают фильтровальной бумагой и высушивают при 110—120°С в течение 8—10 мин [625].
Полоски электрофореграмм можно также окрашивать, погружая их на 6 мин в раствор, содержащий 0,5 г бромфеноло-
вого синего, 450 мл абсолютного этанола и 50 мл ледяной уксусной кислоты. Избыток красителя удаляют, промывая бумажные полоски в 0,2%-ном растворе уксусной кислоты в метаноле [13]. Интенсивность окраски полос можно увеличить, если подержать электрофореграммы в парах аммиака. Для количественного определения разделенных белков окрашенные зоны элюируют 0;01 н. NaOH или 0,5%-ным №гСОз ’[728].
Белки йосле электрофореза на бумаге или ацетате целлюлозы окрашивают также бромкрезоловым зеленым (0,2%-ный раствор в этаноле, содержащем 2% ледяной уксусной кислоты). Обесцвечивание фона проводят в 2%-ной уксусной кислоте. После обесцвечивания и высушивания электрофореграммы помещают в пары аммиака. Синняя окраска медленно исчезает [336]. Уэбстер и др. .[1381] исследовали возможность применения этого красителя для определения сывороточного альбумина после электрофореза на ацетате целлюлозы. Для количественной оценки окрашенную зону альбумина элюируют 3%-ным (объем/объем) раствором детергента Teepol 610. Элюция занимает всего несколько минут. Количество альбумина определяют по оптической плотности при 520 нм. Было изучено также взаимодействие выделенных фракций глобулинов сыворотки с бромкрезоловым зеленым ,[1381].
Для окрашивания белков после электрофореза на бумаге можно использовать азокармин В по методике, описанной для амидового черного 10 В. Полоски электрофореграмм помещают на 10 мин в раствор азокармина В в смеси 90%-ного метанола и 10%-ной уксусной кислоты. Фон обесцвечивают той же смесью растворителей [711]. Белки в агаровом геле окрашивают 0,05%-ным раствором азокармина в смеси, состоящей из 20 мл ледяной уксусной кислоты, 150 мл глицерина и 830 мл воды ;[1329].
В некоторых случаях всем остальным белковым красителям следует предпочесть нигрозин (С. I. 50420). Ли [751] показал, что в полиакриламидных гелях глютеновые белки окрашиваются водорастворимым нигрозином лучше, чем амидовым черным. Для окрашивания гели выдерживают 3 ч в смеси метанол — вода — уксусная кислота (4:5:1 по объему), содержащей 0,0125% нигрозина, а затем обесцвечивают в той же смеси растворителей. Гели можно хранить в 5%-ной уксусной кислоте. Найдено, что нигрозин имеет ряд преимуществ при окрашивании белков эндосперма пшеницы ;[250], а также белков, преципитирующих в иммунологических реакциях.
