Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Арагансилло и др. [49] изучали влияние различных условий на окрашивание протеолипидов (называемых в указанной работе белками СМ) эндосперма пшеницы и глиадинов после электрофореза в крахмальном геле. При сравнении эффективности
0 05%-ного и 6,5%-ного растворов нигрозина в смесях метанол— уксусная кислота — вода (5:5:1 по объему) и в 50%-ном водном растворе уксусной кислоты было обнаружено, что белки СМ лучше всего окрашиваются в 0,05%-ном растворе нигрозина в смеси метанол — уксусная кислота — вода. Для глиадинов же лучше использовать более концентрированный раствор нигрозина. Во всех указанных случаях нигрозин оказался более чувствительным красителем, чем амидовый черный.
Пунцовый S также относится к широко распространенным красителям. Особенно часто его применяют после электрофореза на ацетате целлюлозы. Белки можно окрашивать 0,15— 0,20%-ным раствором пунцового S в 3%-«ой ТХУ. Для этой процедуры вполне достаточно 5 мин. После промывания элект-рофореграмм 5%-ной уксусной кислотой на светлом фоне проявляются четкие полосы ,[251, 694]. Краситель экстрагируют и» окрашенных зон 0,4 М NaOH или вероналовым буфером.
Пунцовый S можно применять для обнаружения белковых зон и после электрофореза в гелях. Монтье и др. [881] предложили для этой цели 2%-ный раствор красителя в 5%-ной ТХУ. Даудинг и Тарноки |[313] описали аналогичный метод с применением 0,6%-ного раствора красителя в 3%-ной ТХУ. Избыток красителя удаляют промыванием гелей 5—10%-ными
водными растворами уксусной кислоты.
Следует отметить некоторую неопределенность, связанную с номенклатурой пунцового S. Это название применяют к двум номерам в каталоге C.I. (27195 и 127195), а кроме того, пунцовый S обозначают еще как яна алый и кислый красный 112. Кон и Мефам [697] недавно обсуждали этот вопрос и предложили применять название кислый красный 112 (С. I. 127195).
Окрашивание белков быстрым зеленым FCF (пищевой зеленый 3, C.I. 42053), по-видимому, имеет преимущества при их количественной денситометрии в полиакриламидном геле {453]. Гели погружают на 2 ч в раствор, содержащий 1% (масса/ объем) быстрого зеленого в 7%'-ной уксусной кислоте. Обесцвечивание фона проводят путем повторных промываний электрофо-реграмм 7%-ной уксусной кислотой. Для цилиндрических гелей диаметром 6 мм линейная зависимость между площадью пика на денситограмме и количеством нанесенного белка сохраняется вплоть до 150—200 мкг. Показано, что по своей чувствительности данный метод сравним с методами, основанными на использовании амидового черного. Он позволяет обнаруживать 1—3 мкг белка в одной полосе. Быстрый зеленый пригоден для количественного определения гистонов после их электрофореза в полиакриламидном геле [856].
Для окрашивания белков можно также применять краситель «стэйнзол» (от англ. «Stains АН» — окрашивает всё), представ*
ляющий собой (1-этил-2-[3-(этилнафто[1,2с1]-тиазолин-2-или-дин)-2-метилпропенил]-нафто[1,2(1]-тиазолийбромид. Перед использованием основной раствор, содержащий 0,1% «стэйнзола» в 100%-ном фчрмамиде, разбавляют в 20 раз и доводят концентрацию формамида в воде до 50% (pH 7,4). Поскольку краситель обладает фоточувствительностью, не следует подвергать гель воздействию света во время окрашивания белков и обесцвечивания фона. Гели можно отмывать проточной водой. Белки выявляются в виде красных полос [268]. Грин и др. [472] описали метод окрашивания фосфопротеидов этим карбоциани-новым красителем. Красящий раствор готовят непосредственно перед употреблением, смешивая 10 мл описанного выше основного раствора, 10 мл формамида, 50 мл изопропанола и 1 мл
3 М буфера трис-НС1, pH 8,8; затем объем доводят до 200 мл деионизированной водой. Такой раствор был успешно использован для окрашивания белков после электрофореза в кислой среде в присутствии мочевины. ДСН мешает окрашиванию белков по описанному способу. Поэтому его удаляют, нагревая гель в течение 15 мин при 50СС в 25%-ном изопропаноле (30 мл на каждый гель) [358]. Фосфорилированные белки после такой обработки образуют полосы синего цвета. При ежедневном сканировании фракции казеина в течение трех дней не было обнаружено никаких изменений в интенсивности окраски или спектре поглощения.
Существует другой тип красителей, вступающих с белками ¦в химическое взаимодействие с образованием окрашенных продуктов, в которых краситель связан с молекулой белка ковалентной связью.
К красителям такого типа относится проционовый яркий синий RS (проционовый яркий синий M-R, MRS, реактивный синий 4). Впервые применение этого красителя для окрашивания (белков описали Фазекас де Грот и др. [367]. Молекула процио-нового яркого синего содержит помимо хромофора хлорзаме-щенную триацинильную группу, которая обладает высокой реакционной способностью и может соединяться при отщеплении :НС1 с гидроксильной, аминной или амидной группами. В щелочной среде краситель взаимодействует с водой, поэтому для окрашивания следует применять свежеприготовленные растворы. Спектры поглощения свободного и связанного с белком красителя очень сходны; в обоих случаях имеется широкий максимум при 602 нм. Фазекас де Грот и др. [367] предложили следующий метод окрашивания белков после электрофореза на ацетате целлюлозы. Полоски пленки помещают без предварительной обработки в раствор метанола, содержащий 5 г/л проционового яркого синего RS и 20 мл/л концентрированной НС1. Через 5 мин полоски дважды промывают (каждый раз в течение
