Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Гааль Э. -> "Электрофорез в разделении биологических макромолекул" -> 107

Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.

Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул — М.: Мир, 1982. — 448 c.
Скачать (прямая ссылка): elektroforezvrazdeleniibiologicheskih1982.djvu
Предыдущая << 1 .. 101 102 103 104 105 106 < 107 > 108 109 110 111 112 113 .. 185 >> Следующая

5 мин) метанолом и высушивают. В более длительном окрашивании нет необходимости, хотя оно и не вызывает повышения фона. При денситометрии электрофореграмм, окрашенных про-ционовым ярким синим, обнаруживается линейная зависимость между площадью пиков и количеством белка, нанесенного на 1 см стартовой линии. Таким образом, этот краситель можно-использовать для количественного определения белков после электрофореза на ацетате целлюлозы. При электрофорезе в гелях удаление избытка красителя представляет определенные: трудности |[276].
Другой реакционноспособный краситель — ремазоловый яркий синий R (реактивный синий 19, C.I. 44035) был применен> для окрашивания белков перед электрофорезом [480]. Так как. обработка белков этим красителем приводит к снижению их растворимости в отсутствие ДСН, данную методику предварительного окрашивания следует использовать лишь при электрофоретическом разделении белков в присутствии детергента [1247]. Предварительное окрашивание белков сыворотки крови этим красителем в условиях, в которых не происходило осаждения белков, вызывало изменение их поведения при электрофорезе [277].
Описан чувствительный метод окрашивания белков с помощью одного из производных ремазолового яркого синего R ,[276,. 277], позволяющий проводить полуколичественный анализ результатов после электрофореза в полиакриламидном геле.
Для обнаружения белков после электрофореза можно' также применять хорошо известную реакцию белков с 2,4-динитро-фторбензолом [200, 1154]. Гели погружали в 2,5%-ный раствор, 2,4-динитрофторбензола, выдерживали их в течение 16 ч в темноте и затем многократно промывали эфиром, подкисленным НС1. Чувствительность обнаружения БСА этим методом была; почти такой же, как и при использовании амидового черного-10 В. Окрашенные 2,4-динитрофторбензолом белки, присутствующие в вырезанных зонах, можно прямо подвергать гидролизу для определения N-концевой аминокислоты, что позволяет получить представление о чистоте разделенных белков.
Существуют очень чувствительные методы обнаружения белков, основанные на тушении флуоресценции или введении флуоресцентной метки. Некоторые примеры были приведены в разд-1.15.1.
Был описан очень чувствительный метод идентификации » количественного определения белков в агаровых и агарозных гелях |[671]. Белки осаждали смесью спирта и уксусной кислоты или антисывороткой. Затем пластинки геля погружали на 5 мин в 2%-ный раствор ферроцианида калия. В среде, близкой к нейтральной, ферроцианид связывается с белками. Связанный фер-
роцианид переводили в серебряную соль, из которой под действием «физического проявителя» образовывались зерна серебра микроскопических размеров [422]. Этот метод можно применять для количественного определения белковых фракций сыворотки, содержащих 2—250 мкг белка ,[672]. Он обладает примерно такой же воспроизводимостью, как и методы окрашивания белков амидовым черным.
Разрабртаны специальные методики для окрашивания отдельных классов белков. Так, например, фосфорилированные белки можно обнаруживать с помощью следующей процедуры [264]. После электрофореза белки фиксируют 10%-ным раствором сульфосалициловой кислоты. Затем гели промывают несколько раз тем же раствором для удаления фосфорсодержащих низкомолекулярных веществ и погружают не менее чем на 1 ч в 0,5 М раствор СаС1г. После этого гели быстро промывают водой и выдерживают в течение 30 мин при 60 °С в 0,5 н. NaOH. Далее гели многократно промывают 1%-ным водным раствором молибдата аммония и вымачивают 30 мин в 0,5%-ном раство-ipe метилового зеленого в 7%-ной уксусной кислоте. Избыток красителя удаляют 10%-ной сульфосалициловой кислотой. Метод позволяет обнаружить 1 нмоль фосфора, связанного с белком.
Другой метод обнаружения фосфопротеидов основан на характерном окрашивании этого класса белков «стэйнзолом» 1472].
Для выявления нейрофизинов после электрофореза в полиакриламидном геле предложен метод [880], в основе которого лежит реакция с фуксиновым альдегидом. Метод, по-видимому, специфичен для белков с высоким содержанием цистеина.
Ряд методов позволяет проводить специфическое окрашивание гемоглобина, трансферрина и других железосодержащих белков. Кларк [236] использовал с этой целью реагент, содержавший 0,2 г бензидина и 0,5 мл уксусной кислоты в 100 мл воды. Непосредственно перед употреблением к этому раствору добавляли 0,2 мл 30%-ной перекиси водорода. Через 30 мин появлялись синие полосы, которые при хранении постепенно -бледнели.
Для обнаружения железосодержащих белков можно также применять чувствительный реактив на железо — 4,7-дифенил-1,10-фенантролин (батофенантролин). Гели погружают на 1—2 ч в свежеприготовленный 0,01%-ный раствор батофенантролина, в котором присутствует примерно 0,02 М ацетат натрия; затем к этому раствору добавляют 0,1 мл тиогликолевой кислоты. Через несколько минут гели многократно промывают 2%-ной уксусной кислотой. Железосодержащие белки выявляются в виде красных полос [1326].
Линдер-Горовитц и др. [768] использовали для обнаружения ферритина реакцию образования берлинской лазури. Полиакриламидные гели помещали на 1ч в 2%-ный раствор K4Fe(CN)e в 2%-ной НС1 и затем промывали дистиллированной водой.
Предыдущая << 1 .. 101 102 103 104 105 106 < 107 > 108 109 110 111 112 113 .. 185 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed