Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Электрофорез проводят обычным способом, а затем на элек-трофореграмму осторожно, следя за тем, чтобы обе поверхности полностью соприкасались, накладывают индикаторный гель, содержащий субстрат, соответствующий буфер и кофакторы. Этот «сэндвич» инкубируют во влажной камере. После инкубации индикаторный гель (а в некоторых случаях исходную элек-трофореграмму) окрашивают для обнаружения продукта ферментативной реакции. Таким образом, этот метод дает контактный отпечаток зон, содержащих ферменты. Иногда индикаторный гель заменяют полоской фильтровальной бумаги. Обычно индикаторные гели готовят из агара или крахмала и значительно реже — из акриламида. Следует отметить, что данный метод позволяет также обнаруживать ферменты, имеющие низкомолекулярные субстраты.
5. В некоторых случаях продукт реакции, катализируемой исследуемым ферментом, превращают в окрашенное соединение, используя для этого какой-либо вспомогательный фермент.
При обнаружении ферментов после электрофореза, как и в любой ферментативной реакции, важную роль играет pH среды. Этот фактор имеет особенно большое значение тогда, когда электрофорез проводят при значении pH, сильно отличающемся от оптимума pH для данной ферментативной реакции, а также при разделении белков путем изоэлектрофокусирования в неоднородной буферной системе с разными значениями pH. В этих случаях перед определением активности фермента гели инкубируют в охлажденном буфере с соответствующим значением pH.
Хотя электрофоретическое разделение изоферментов с целью определения количества разделенных компонентов проводят до-
вольно часто, проблеме количественного анализа энзимограмм до сих пор уделялось сравнительно мало внимания. При этом нередко применяют методы, широко используемые для определения белков в зонах, окрашенных специфическими белковыми красителями. Энзимограммы сканируют с помощью денситометров и вычисляют площади пиков, которые служат мерой ферментативной активности. Другие методы количественной оценки ферментов' основаны на элюции и последующем определении ферментативной активности в растворе или на элюции окрашенного продукта, образовавшегося под действием фермента in situ.
В методах классической энзимологии определение ферментативной активности осуществляют в таких условиях, в которых фактором, лимитирующим скорость реакции, является количество фермента. Если же активность фермента определяют в геле, то прежде всего необходимо, чтобы субстрат имел возможность диффундировать в гель. Скорость проникновения субстрата в гель зависит среди прочих факторов от его концентрации, поэтому при снижении концентрации субстрата в инкубационной смеси скорость его проникновения в гель также снижается. Чтобы предотвратить значительное уменьшение концентрации субстрата, используют относительно большой объем реакционной смеси.
Превращение субстрата начинается сразу после того, как он вступает в контакт с ферментом. Концентрация субстрата в данной точке геля зависит как от скорости проникновения субстрата в гель, так и от скорости ферментативной реакции. Непрореагировавшие молекулы субстрата диффундируют в более глубокие слои геля и благодаря высокой концентрации фермента подвергаются быстрому превращению. Следует также иметь в виду, что субстрат может достигать зоны данного фермента, двигаясь не только в направлении, перпендикулярном поверхности геля, но и параллельно ей. Кроме того, во время инкубации молекулы фермента не фиксированы в геле и могут диффундировать из зоны, сформировавшейся во время электрофореза. Перечисленные эффекты служат причиной образования «каймы» по краям зоны, содержащей фермент, что может приводить к ошибкам при денситометрии. Проблемы количественного анализа энзимограмм рассматриваются в обзоре Виме [1420].
Несмотря на большое число факторов, которые могут мешать определению ферментативной активности, во многих случаях наблюдается почти линейная зависимость между количеством присутствующего в зоне фермента и площадью соответствующего пика на денситограмме. Для иллюстрации практических последствий, вытекающих из рассмотренных выше трудностей^
остановимся кратко на примере количественного определения лактатдегидрогеназы (ЛДГ).
Фриц и др. [408] обнаружили, что соотношение между изоферментами ЛДГ, выявленными с помощью электрофореза в геле и последующего специфического окрашивания разделенных зон, зависит от количества нанесенного на гель белка. Более того, соотношение изоферментов, определенное при электрофорезе, отличается от их соотношения при измерении другими методами. Меньшие количества фермента обнаруживали более высокую относительную активность, что, вероятно, объясняется медленным проникновением в гель субстрата и сопрягающего агента. При электрофорезе в микрогелях изоферментов глюко-зо-6-фосфатдегидрогеназы подобных отклонений не наблюдалось [257]. В этом случае субстраты, коферменты, сопрягающие агенты и другие низкомолекулярные соединения очень быстро проникают в гель, благодаря чему обеспечивается постоянный избыток субстрата и других реагентов. Таким образом, микрогель можно рассматривать как «микрокювету» и использовать его для количественного определения пикограммовых количеств ферментов, а также для изучения кинетики ферментативных реакций. Детальное описание этих методов дается в работе Ней-хоффа [915].
