Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
При электрофоретическом разделении ферментов можно применять множество различных систем буферных растворов и гелей. Однако в некоторых случаях следует позаботиться о том, чтобы предотвратить денатурацию белков в процессе электрофореза. Так, например, нельзя использовать буферы с чрезмерно высокими или низкими значениями pH, а при исследовании термолабильных ферментов необходимо тщательно охлаждать систему. В качестве носителей при разделении ферментов обычно применяют ацетат целлюлозы или гели. Бумага для этих целей непригодна, так как она сильно адсорбирует ферменты.
После отключения тока в конце электрофореза диффузия разделенных молекул продолжается, поэтому локализацию ферментов нужно проводить как можно быстрее.
В большинстве случаев способ обнаружения фермента состоит в том, что электрофореграмму разрезают на небольшие участки, элюируют из них фермент и определяют его активность обычными методами. Такая методика позволяет проводить количественное определение ферментативной активности, однако иногда при этом снижается степень разрешения, поскольку фрагменты геля, как правило, шире, чем зоны разделенных белков. С точки зрения разрешающей способности более предпочтительными являются методы локализации ферментов in situ. Краткое описание таких методов дается в настоящей главе.
При определении активности ферментов на электрофореграммах должны выполняться те же условия, что и при определении ферментов в тканях и клетках. Поэтому многие методы, применявшиеся первоначально в гистохимии, используют в оригинальной или модифицированной форме для локализации ферментов в гелях и других поддерживающих средах. В то же время некоторые методы определения ферментативной активности
в растворах также пригодны для выявления ферментов в гелях.
Анализируемый фермент должен специфически катализировать реакцию (или реакции), с помощью которой его выявляют на электрофореграмме. Поскольку диффузия продуктов реакции может снижать степень разрешения, предпочтительными являются реакции, приводящие к образованию нерастворимых продуктов. -
Методы локализации ферментов in situ можно разделить на несколько типов:
1. Существует множество методов, основанных на взаимодействии фермента с хромогенным субстратом, который сам по себе бесцветен или отличается по цвету от продукта реакции. Появление окрашенных полос говорит о местонахождении фермента.
2. В некоторых случаях неокрашенный продукт ферментативной реакции переводят в окрашенное соединение химическим путем. Так, например, для обнаружения эстераз, амидаз и фос-фатаз можно использовать в качестве субстратов эфиры, амиды и фосфаты нафтола. Гели инкубируют в присутствии одного из таких субстратов; образующийся при этом бесцветный нафтол вступает в реакцию с какой-либо солью диазония, в результате чего возникает окрашенный азокраситель.
Существуют два методических варианта проведения этой процедуры:
а) гели инкубируют в растворе, содержащем одновременно субстрат и соль диазония;
б) гели инкубируют в забуференном растворе субстрата, а затем переносят их в раствор, содержащий соль диазония.
Первый вариант называют «методом одновременного сочетания», а второй — «методом сочетания после инкубации». Метод одновременного сочетания имеет преимущество, так как при его применении не столь велика опасность диффузии продукта и нет необходимости в повторной инкубации.
3. Метод включения в гель субстрата или затравки. При использовании высокомолекулярного субстрата или затравки инкубация геля в растворе субстрата дает лишь весьма посредственные результаты, поскольку субстрат плохо проникает в гель и реакция происходит только на его поверхности. Проблема может быть решена путем включения субстрата в гель перед проведением электрофореза. В этом случае гели после электрофореза инкубируют в буферном растворе с подходящим значением pH или во влажной камере, а затем проводят окрашивание макромолекулярного субстрата. После обесцвечивания гелей в местах локализации фермента выявляются бесцветные или менее интенсивно окрашенные полосы. При использовании техники включения субстрата в гель должны выполняться два
важных условия: во время электрофореза субстрат не должен мигрировать и разрушаться. Если в гель включены нуклеиновые кислоты, то первое условие не представляет серьезной проблемы, так как размеры пор полиакриламидных гелей, применяемых для разделения белков, достаточно малы, чтобы помешать нуклеиновым кислотам перемещаться при электрофорезе. Включенные в гель РНК и ДНК могут быть использованы в качестве субстрата для рибонуклеазы и затравки для ДНК-полимеразы соответственно. Чтобы обеспечить неподвижность белков при электрофорезе, применяют нерастворимые формы белков, смешивая их с гелеобразующим раствором. Действие ферментов во время электрофореза можно подавить путем надлежащего охлаждения геля.
4. Метод индикаторного геля. Этот метод часто применяют при электрофорезе на полосках ацетата целлюлозы, а также в тех случаях, когда для локализации ферментов приходится использовать высокомолекулярный субстрат.
