Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Различные белки окрашиваются кумасси ярким синим R-250 почти в одинаковой степени. Площади пиков на денситограмме находятся в линейной зависимости от количества нанесенного белка в сравнительно широком его диапазоне (вплоть до 10 мкг белка, нанесенного на полоску пленки шириной 1 см). Таким образом, метод вполне пригоден для количественного анализа разделенных белков.
Кумасси яркий синий можно применять для окрашивания электрофореграмм, полученных не только на пленках из ацетата целлюлозы, но и на других поддерживающих средах, таких, как фильтровальная бумага, агаровый и крахмальный гели [367] или полиакриламидный гель ,[867]. К настоящему времени описано большое число различных методов окрашивания белков этим реагентом после их электрофореза в полиакриламидном геле.
Крамбах и др. [234] использовали коллоидный раствор ку-масси яркого синего в 12,5%-ной ТХУ. Поскольку этот краситель имеет низкую растворимость в 12,5%-ной ТХУ, его растворяют в воде и перед употреблением смешивают с раствором ТХУ так, чтобы получились нужные концентрации. После фиксации белков в 12,5%-ном растворе ТХУ гели погружают на 30—60 мин в раствор, содержащий 0,02—0,05% кумасси яркого синего R-250. Обесцвечивание проводить не обязательно, так как коллоидные частицы красителя не проникают в гель. Если окрашенный фон все же появляется, то его устраняют путем вымачивания геля в 7%-ной уксусной кислоте. Для фиксации белков, разделенных в присутствии мочевины, можно использовать раствор, содержащий 5% ТХУ и 5% сульфосалициловой кислоты. Быстрый метод фиксации и окрашивания белков кумасси ярким синим предложили Маурер и Аллен [840]. Гели фиксируют в течение 30 мин при 65 °С в 0,2%-ном растворе кумасси яркого синего в смеси вода — абсолютный спирт —уксусная кислота (45:45:10 по объему). Пластины геля, находящиеся в кювете с красителем, следует через каждые 10 мин переворачивать. (Этот метод можно использовать и для окрашивания белков после ИЭФ.)
Кумасси яркий синий растворяют также в смеси метанол — уксусная кислота — вода (5:1:5 или 1:1:8 по объему). Для обесцвечивания фона используют тот же растворитель [107].
Фишбейн [383] установил, что в водных растворах кумасси яркий синий постепенно разлагается с образованием смолистого остатка. Этот процесс ускоряется под действием ТХУ и замедляется в присутствии этанола. Фишбейн рекомендует использовать 1%-ный раствор красителя в абсолютном этаноле, разведенный в 20 раз 12,5%-ной ТХУ. Окрашивание проводят в течение 12 ч, после чего гели споласкивают метанолом и водой, а затем помещают в 12,5%-ный раствор ТХУ. Увеличение времени окрашивания свыше 12 ч не приводит к повышению интенсивности окраски. При использовании этого метода для анализа «-уреазы минимальное измеримое количество фермента составляло 0,2—0,3 мкг. Верхний предел количества белка, лежащий в линейной области денситограммы, зависит также от длины пути, пройденного этим белком при электрофорезе. С увеличением длины пути увеличивается и то максимальное количество белка, при котором еще сохраняется линейная зависимость. Например, если зона уреазы проходила 9 см, то линейная зависимость между количеством нанесенного белка и площадью пика при денситометрии сохранялась в диапазоне 1—55 мкг, а при перемещении той же зоны только на 2 см верхний предел этого диапазона составлял 12 мкг белка.
Количество белка, которое можно определить методом денситометрии, зависит также и от длины волны, применяемой при сканировании [107]. Так, например, при длине волны 550 нм» т. е. в той области, где чувствительность детектирования максимальна, это количество находится в пределах 0—15 мкг, тогда как при длине волны 400 или 500 нм оно должно быть в три раза больше.
Другой способ количественного определения белков основан нэ элюции красителя из белковых зон после окрашивания и обесцвечивания электрофореграмм в стандартных условиях. Феннер и др. [374] окрашивали гели 0,5%-ным раствором кумасси яркого синего R-250 в 50%-ном водном метаноле, содержавшем 7,5% уксусной кислоты, по методу, который предложили Бикл и Траут [119]. После обесцвечивания фона окрашенные зоны вырезали и краситель экстрагировали из кусочков геля 25%-ным водным пиридином (объем/объем), встряхивая их при комнатной температуре до тех пор, пока не наступало равновесие, что определяли путем повторных измерений поглощения раствора. Пиридин смещает максимум поглощения красителя с 550 до 605 нм, поэтому измерение поглощения проводили при 605 нм. Этот метод позволяет определять белки в пределах 1 —100 мкг. Он особенно полезен при двухмерном электрофорезе на пластинах геля, поскольку их сканирование представляет в настоящее время определенные технические трудности.
Кумасси яркий синий G-250 (ксилоловый яркий цианин G, С. I. 42 665) по своей структуре сходен с кумасси ярким синим R-250, но содержит две дополнительные метильные группы. Ди-зел и др. {302] предложили использовать его для окрашивания белков в полиакриламидном геле. Гели погружают на 5 мин в 12,5%-ную ТХУ, затем к 40 мл этого фиксатора добавляют 2 мл 0,25%-ного (масса/объем) водного раствора кумасси яркого синего G-250 и тщательно все перемешивают. С помощью данного метода белковые полосы хорошо прокрашиваются, и уже через 30 мин после электрофореза электрофореграммы можно фотографировать, не проводя их обесцвечивания, поскольку этот краситель еще менее, чем R-250, растворим в воде и почти не проникает в гель. При хранении гелей в 5%-ной уксусной кислоте интенсивность окраски белковых зон значительно увеличивается, по всей вероятности, вследствие диффузии красителя внутрь белковой зоны. Гели можно хранить в течение 8—10 нед без существенного снижения интенсивности окраски.
