Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Очень большое число ферментов было определено после электрофореза на различных носителях. В настоящей главе приведен ряд методов локализации некоторых ферментов in situ.
11.6.1. Дегидрогеназы
Изоферменты ЛДГ, которым посвящены многие работы, а также другие iNAD- и NADP-зависимые оксидоредуктазы обнаруживают, как правило, путем переноса водорода с NADH или NADPH (образующихся в данной ферментативной реакции) на соли тетразолия при участии феназинметосульфата (ФМС). Конечный продукт этих реакций представляет собой окрашенный нерастворимый формазан [298, 300, 301, 1062, 1339]. Применяемые для этих целей соли тетразолия должны иметь близкий к нулю окислительно-восстановительный потенциал и не должны реагировать с молекулярным кислородом. Желательно также, чтобы образующийся формазан обладал высоким коэффициентом молярной экстинкции, поскольку от этого зависит чувствительность определения. Наиболее часто используют такие соли тетразолия, как нитротетразолиевый синий (НТС; 3,3'-дианизол-4,4/-бис-2-[п-нитрофенил] -5-фенилтетразолийхлорид), иоднитро-тетразолий (ИНТ; 3-п-нит|рофенил-2-[п-иодфенил]-5-фенилтетразолийхлорид) и МТТ (3-[4,5-диметилтиазолил-2]-2,5-дифенилтет-разолийбромид).
После электрофореза электрофореграммы погружают в забут ференный раствор, содержащий лактат натрия или лития (0,05—1,0 М), NAD+ (0,05—1,0 мг/мл), ФМС (0,02—0,2мг/мл) и соль тетразолия (0,02—0,2 мг/мл). В качестве буфера часто используют 0,1—0,3 М трис-НС1, pH 7,4. Компоненты растворяют каждый в отдельности и смешивают в указанных концентрациях непосредственно перед использованием.
Инкубацию следует проводить в темноте, но гели можно периодически просматривать, чтобы следить за процессом окрашивания. Ферментативную реакцию останавливают, добавляя к смеси 7%-ную уксусную кислоту. В ней можно и хранить гели. Для определения активности ЛДГ были с успехом использованы многочисленные варианты реакционной смеси, сходные с описанной выше, но слегка отличающиеся от нее по концентрации компонентов. Некоторые авторы предлагают добавлять к реакционной смеси NaGN (298, 1062, 1334]. Если электрофорез проводят на ацетате целлюлозы, то NaCN можно не добавлять. Роль цианида, по-видимому, заключается в том, что он подавляет оксидазы, окисляющие тетразолий и таким образом препятствующие образованию формазанов [934]. В некоторых методиках к реакционной смеси кроме NaCN (в конечной концентрации 50 мг/мл) добавляют NaCl и соли магния в концентрации 10 и 1 мМ соответственно. При разделении бактериальных дегидрогеназ было обнаружено [1190], что включение в реакционную смесь MgCb приводит к уменьшению окраски фона полиакриламидного геля.
При определении дегидрогеназ используют также и другие буферные растворы с различными значениями pH. Так, например, Фриц и др. {4081 для локализации ЛДГ применяли NaOH — глициновый буфер, pH 10,0. Очень важное значение имеет концентрация лактата в инкубационной среде, поскольку она оказывает заметное влияние на соотношение выявленных изоферментов. Из сказанного следует, что определение ферментативной активности всегда следует проводить в строго стандартных условиях.
Для локализации ЛДГ применяют также обратную реакцию, т. е. превращение пирувата в лактат [1280].
В некоторых случаях образование формазанов наблюдается в отсутствие специфических субстратов дегидрогеназы. Подобное явление происходит, вероятно, в результате неферментативной реакции [1046]. Такое неспецифическое образование формазанов усиливается с повышением pH, увеличением времени инкубации и концентрации ФМС. Оно не требует присутствия пиридиновых нуклеотидов [1210]. Возможно, к неспецифическому образованию формазанов приводит восстановление солей тетразолия белками.
Дегидрогеназы можно также обнаруживать по флуоресценции восстановленных пиридиновых нуклеотидов, которая возникает при облучении электрофореграммы ультрафиолетовым светом. В этом случае ФМС и соль тетразолия не обязательно должны присутствовать в смеси. Поскольку восстановление пиридиновых нуклеотидов происходит в ходе самой ферментативной реакции, этот метод обладает высокой специфичностью и результаты опытов не зависят от побочных эффектов, связанных с неспецифическим образованием формазанов.
Образование формазанов, равно как и флуоресценцию, можно использовать для обнаружения многих других дегидрогеназ при наличии в инкубационной среде соответствующего субстрата, кофермента и буфера. Некоторые примеры подобных мето^ дов приведены в табл. 7.
Таблица Т
Обнаружение дегидрогеназ
Фермент
Субстрат
Источник данных
Алкогольдегидрогеназа
Альдегиддегидрогеназа Дигидрооротатдегидрогеназа Дигидроурацилдегидрогеназа Фукозодегидрогеназа Глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназа Глутаматдегидрогеназа Глицеральдегид-З-фосфат — дегидрогеназа Гексозо-6-фосфат — дегидрогеназа
Г истид-инолдегидрогеназа Г омосериндегидрогеназа Р-Г идроксибутиратдегидроге-наза
Г идроксистероиддегидрогеназа
20-рчгидроксистероиддегидро-
