Электрофорез в разделении биологических макромолекул - Гааль Э.
Скачать (прямая ссылка):
Глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназа1 Альдолаза, триозофосфатизомераза, глицеральде-гид-3-фосфат— дегидрогеназа
Глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназа Глюкозо-6-фосфат — дегидрогеназа1* Глицеральдегид-З-фосфат— дегидрогеназа ЛДГ
[1353V
[987]
[221]
[100]
[1247],
[1112}
[1117].
[409]
[1371];
[246]
[1211,
1475]
[1367b
[925]
[810]
[518],
[412],
[221
[890|
[518Ji
[926J,
[284,
516],
[518].
[221]
[153,
1446]
*) Включали в полиакриламидный гель перед проведением электрофореза.
геля. Харрисон [518] обнаружил, что бмс-акриламид защищает фермент. По его мнению, многие другие ферменты, кроме глю-козо-6-фосфат — дегидрогеназы, также могут быть иммобилизованы в геле без сколько-нибудь заметной потери активности. В работе Харрисона концентрация в геле вспомогательного фермента была столь низкой, что практически не изменяла фона яри окрашивании белков кумасси ярким синим.
Если электрофорез проводят на пленках из ацетата целлюлозы, то рекомендуется покрывать их тонким слоем агарового геля, содержащего смесь реагентов. Б этом случае можно получить контактный отпечаток электрофореграммы на фотографической бумаге, используя флуоресценцию кофермента при волне возбуждения 340 нм. С помощью таких методов были обнаружены альдолазы и некоторые другие ферменты [1251].
Примеры выявления ферментов путем сочетания их специфических реакций с действием соответствующих дегидрогеназ приведены также в табл. 6.
11.6.2. Пероксидазы
Простейший метод обнаружения ферментов этого класса заключается в том, что электрофореграмму погружают в раствор перекиси водорода. Пузырьки кислорода на поверхности геля указывают положение фермента [1321]. Однако этот метод не позволяет получать стойкие энзимограммы и обладает низкой чувствительностью.
Для выявления в геле каталазной активности можно использовать реакцию между крахмалом и иодом. Этот метод особенно удобен в том случае, если электрофорез проводится в крахмальном геле. Что касается полиакриламидного геля, то его приходится сначала вымачивать в Н2О2, а затем в растворе, содержащем крахмал и иод [503]. Чувствительный метод обнаружения каталазы описали Вудбури и др. ,[1447]. Гели промывали в течение 15 мин тремя порциями дистиллированной воды. Промытые гели погружали на 10 мин в 0,003%-ный раствор Н2О2, споласкивали дистиллированной водой и помещали еще на 10 мин в раствор, содержащий FeCl3 (10%) и K3Fe(CN)e, который заменяли затем дистиллированной водой. Хранить гели следует в темноте и извлекать на свет только для просматривания. Зоны, содержащие каталазу, имели вид желтых полос на темно-зеленом фоне берлинской лазури.
Реймонд [1062] описал метод обнаружения гаптоглобинов, основанный на их пероксидазной активности. Инкубационная -смесь содержала 200 мл воды, 2 мл ледяной уксусной кислоты, 200 мг о-дианизидина й 0,4 мл 30%-ной перекиси водорода. Гептоглобин выявлялся в виде коричневато-красной полосы.
Для локализации изоферментов пероксидаз после их разделения методом ИЭФ была разработана [288] методика «отпечатков на бумаге». Фильтровальную бумагу вначале пропитывают буфером и высушивают при комнатной температуре. На этой стадии следует использовать нелетучий буфер, обладающий достаточно большой буферной емкостью, чтобы он мог поддерживать постоянное, значение pH вдоль всего отпечатка, противодействуя буферной емкости амфолитов, присутствующих в тонком слое поддерживающей среды, в которой проводят ИЭФ. Следовательно, оптимальная концентрация буфера, используемого для пропитывания бумаги, зависит от ее толщины. Для насыщения бумаги ватман ЗММ применяли буфер, содержащий 0,1 М цитрат и 0,2 М фосфат, а для бумаги шлейхер-шуль 2043 b — тот же буфер, но в два раза более концентрированный. Пропитанная буфером бумага после высушивания может храниться в течение нескольких недель. Перед использованием ее пропитывают смесью первичного и вторичного субстратов, растворенных в метаноле до конечной концентрации 1—2%. Затем эту бумагу накладывают на тонкий слой поддерживающей среды, в которой проводилось ИЭФ. Полученный отпечаток снимают и высушивают при комнатной температуре или в сушильном шкафу. Из 20 исследованных вторичных субстратов наиболее чувствительными хромогенами оказались о-фенилендиамин и о-дианизидин. С помощью описанного метода можно обнаружить 0,001—0,01 мкг пероксидазы хрена.
Был предложен метод определения относительных активностей изоферментов пероксидаз, разделенных путем электрофореза в крахмальном геле [775]. 20 мл основного раствора бензи-дина (для его приготовления 2 г бензидина растворяют в 18 мл ледяной уксусной кислоты и к ним добавляют 72 мл воды) смешивали с 70,4 мг аскорбиновой кислоты, 20 мл 0,6%-ной Н2О2 н 60 мл воды. Аскорбиновая кислота восстанавливала окисленный бензидин, благодаря чему развитие синей окраски задерживалось до тех пор, пока аскорбиновая кислота не окислялась полностью в процессе инкубации. Время, требуемое для развития окраски, прямо пропорционально концентрации аскорбиновой кислоты и обратно пропорционально активности фермента.
