Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Результаты- выделения вируса из клинического материала с помощью микрочашек хорошо согласуются с результатами выделения его в пробирках (неопубликованные данные). Определенные сложности возникают в связи с токсичностью таких проб, но в большинстве случаев эти сложности можно преодолеть, подбирая соответствующие среды для получения проб, повторно добавляя клеточную суспензию через 24 ч после инокуляции или пересевая культуры.
Выделение вируса проводят в стерильных пластинках, имеющих лунки с плоским или U-образным дном. В каждую лунку добавляют по 1 капле разбавителя, 2 капли пробы и 1 капле клеточной суспензии. Количество пробы в 8 углублениях обычно равноценно инокуле для 2 пробирок с клеточными культурами. Ряды с ис-
Пердая ТЪтробание Вируса (1-йряЬ), Вирус* ингибитор* Клетки-* инкубация -* бобабяени? лмят.
и реинкцбация
I 2 3 4 5 6 т в 9 Ю М I2 Log^ I 2 3 * Ъ 6 7 в 910 II 12
1
| tfeucntVbVltXW JQQ .мая часть ллас-ьХХ П7ШШ1 iXX ____Ч_Л_Л_Л_Л^^ОЦО
©ооооооооооо
eOOOOOQQOQQQ Добабиеяиепоспюятой дозы бируса я каждому разведению шнибитара
Разбедения остаточного бируса
Ряс, 3,12. Техника тестирования остаточного вируса на одной пластинке.
Разрушение вируса: -{-полное; ±частичное; —отсутствует.
следуемым материалом чередуют с рядами контрольного материала, так что на пластинке получается 6 контрольных и 6 опытных рядов. Пластинки закрывают стерильной пластиковой крышкой (Linbro) и инкубируют в термостате, атмосфера которого хорошо увлажнена и содержит повышенное количество СОг (1—2%) для поддержания необходимой величины pH. Если через 24 ч при микроскопическом исследовании обнаруживается токсическое действие на клетки, то снова добавляют I каплю клеточной суспензии. Эти клетки будут расти вместо тех, которые разрушены токсическими веществами. При длительном сохранении токсичности рекомендуется пересев клеток. Пластинки инкубируют 6—8 дней без смены среды и периодически просматривают для определения цитопатического эффекта. При
пересеве клеточный пласт в лунках разрушают кончиком микропипетки и содержимое всех лунок собирают вместе. В лунки на новой пластинке к 1 капле разбавителя добавляют по 2 капли полученной суспензии. Эти новые пластинки инкубируют при прежних условиях. Оставшиеся клетки можно заморозить и использовать позднее. Для идентификации проб, в которых наблюдается цитопатический эффект 4+, в микрочашки добавляют по 1 капле пробы и 1 капле специфической антисыворотки; смесь инкубируют не менее 1 ч при
35 °С. Затем добавляют клетки и пластинки реинкуби-руют в течение 2—7 дней.
При работе с пластинками следует тщательно соблюдать меры предосторожности. Если содержимое лунок из-за неумелого обращения расплескается, то может произойти перекрестное заражение. Ясно также, что в таких условиях неосторожное обращение с пробами, содержащими неизвестные агенты, может быть опасным и для самого работающего.
К настоящему времени с использованием первичных, полупостояйных (диплоидные клетки легких) и постоянных культур этим методом выделены аденовирусы, вирусы полиомиелита, герпеса, гриппа и ECHO.
Этот метод не применим в тех случаях, когда необходимы особые условия культивирования, как, например, вращение пр'обирок для выделения риновируса.
К числу явных достоинств такого метода выделения относится также то, что цитопатический эффект часто обнаруживается раньше, и поэтому для идентификации вируса требуется от 4 до 6 сут.
Б. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ
Большинство вирусологических тестов на культурах, выращиваемых в пробирках, основано на исследовании патологических изменений в клетках, торможении клеточного метаболизма, агглютинации эритроцитов или на применении специфических красителей, которые свидетельствуют о размножении вируса или его подавлении. Результаты оцениваются либо микро- или макроскопическим изучением клеток, либо по изменениям 'со-
ответствующих индикаторов. Этими же методами оценки результатов можно пользоваться и при работе с микросистемами.
1. Патологические изменения в клетках
Дегенерацию неокрашенных живых клеток, вызванную вирусом, можно наблюдать в инвертированном микроскопе. При малых увеличениях (35X) клеточный
Р.ис. 3.13. Морфология интактных и инфицированных вирусом клеток НЕр-2, культивируемых в микрочашках; окрашивание гематоксилин-
эозином (20Х),
А. Неинфищфованные клетки. В. Респираторный синцитиальный вирус, В, Вирус полиомиелита, тип, 3. Г. Вирус герпеса. Д, Вирус оспоаакцины, Е. Аденовирус, тип, 7,
монослой виден целиком. Это позволяет наблюдателю быстро произвести полную оценку, тогда как при работе с культурами в пробирках нужно исследовать по
Рис. 3.14. Монослой окрашеЕшых клеток, культивируемых в микрочашках, при разных узеличениях.
Все фотографии уменьшены вдвое при воспротведении [9].
А. Почка обезьяны (окрашивание ратвором МаА-Грюнвальд; 35Х). В. Днпло* ндьые клетки легких человека (окрашивание по Райту; 35Х). В. Эмбриональная почка человека (окрашивание раствором Май Грюнвальд- 100Х). Г. Почка обеаьяны (окрашивание раствором Мяй-Грюнвальд: ЕООХ). Д¦ Ди-
