Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
плоидные клетки легких человека (окрашиваннс но Райту ШОХ). Е. Эмбриональная почка человека (окрашивание раствором Май^ГрюнвальД; 200Х).
несколько полей зрения. Кроме того, двигая пластинки по столику микроскопа, легко сравнить результаты контроля и опыта. Таким образом, исследователь может немедленно, пока в памяти еще свежи зрительные изобра-
жения, оценивать относительное количество разрушенных клеток в двух лунках. Следовательно, оценка результатов, полученных на клеточных культурах в пластинках, менее утомительна и менее субъективна, чем при обычных методах. Пользуясь большими увеличениями, легко различить характер дегенерации клеток,
Рис. 3.15, Макроскопическая оценка окрашенного клеточного монослоя после реакции нейтрализации вируса.
Фотография уменьшена в 3 paja при воспроизведении [9].
вызванный различными группами вирусов. Различные типы патологических изменений в клетках показаны на рис. 3.13.
Клетки можно зафиксировать (фиксатором, который не растворяет пластик) и окрасить непосредственно в лунках (рис. 3.14). Таким образом, возможна либо микроскопическая оценка результатов, либо макроскопическая оценка всего клеточного пласта (рис. 3.15).
2. Метод подавления обмена (колориметрический тест)
Пожалуй, самым простым способом оценки результатов опыта является тест на подавление метаболизма [2—4]. Им легко пользоваться применительно к системе микротитрования [2, 23]. Рис. 3.16 иллюстрирует
тест на подавление метаболизма риновирусом. Для проведения таких тестов Леннет и др. [4] разработали спе-циальную среду, хотя можно пользоваться и обычной средой, состав которой указан выше. Недостаток теста на подавление метаболизма заключается в том, что для
билушг
5 с’ с
Ппапигкрекциоц гягя сыдг-рогпхо
О ООО
рсюскх >
tXXXXX)
эоооо:) эеаео
\ /Пояымз /ие/гиш
Пргдинфпе-
шагнпя
сыСаропиеа
Рис. 3.16. Реакция подавления обмена при определении инфекциои-ности рпнозируса и нейтрализующих свойств сыворотки (темные чашки указывают на подавление обмеЕ1а) Г23].
выявления четких различий в цвете требуется длительный период инкубации. Кроме того, изменения в цвете, вызываемые многими вирусами, трудно различить. Непосредственное же микроскопическое исследование клеток в микрочашках осуществляется очень быстро и выявляет тонкие изменения в морфологии клеток, неразличимые грубым колориметрическим наблюдением.
В. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕРФЕРОНА
Определение интерферона можно проводить в микросистеме [16], причем осуществляется это примерно также, как в культурах в пробирках. Опишем этот ме-
тод в нескольких словах. Исследуемой жидкостью по* крывают клеточный монослой. Культуры инкубируют 24 ч, затем жидкость сливают и клетки заражают определенной дозой интерферон-чувствительного вируса (Синдбис, ECHO-1I). Значительное подавление вирусной инфекции указывает на присутствие интерферона или интерферон-подобных веществ.
Г. ТОРМОЖЕНИЕ ГЕМАДСОРБЦИИ
Некоторые вирусы, такие, например, как миксови-русы, при размножении либо совсем не повреждают клетки, либо повреждают их очень незначительно. Фогель и Шелеков [32] разработали метод, в основе которого лежит явление гемадсорбции. К клеткам, инфицированным вирусом, добавляют суспензию эритроцитов, а затем проводят микроскопическое исследование этих культур. Показано [24, 33], что такая методика в ее микроварианте применима для титрования вирусов группы гриппа и парагриппа. Вульф и др. [25] предложили макроскопическую технику для оценки таких тестов. Мы также использовали макроскопический метод при исследовании миксовирусов и считаем, что полученные результаты вполне согласуются с результатами более сложной микроскопической процедуры. Результаты микро- и макроскопических исследований гемадсорбции, вызванной вирусом, показаны на рис. 3.17 и 3.18 соответственно.
Метод «нейтрализации» миксовирусов или других вызывающих гемадсорбцию вирусов следующий. Смесь вируса и сыворотки предварительно инкубируют в лунках пластинки, затем к этой смеси добавляют клетки вторичных культур почки обезьяны и инкубируют при
36 °С в течение 3—5 суток. Жидкость удаляют декантированием и в каждую лунку добавляют по одной капле (0,025 мл) 0,2%-ной суспензии куриных эритроцитов или эритроцитов морской свинки. Пластинки инкубируют при 4°С в течение 20 мин.
После инкубации пластинки снова помещают при комнатной температуре почти в вертикальном положении и определяют, когда в контрольных культурах (без
Рис. 3.17. Микроскопическое исследование реакции гемадсорбиии, вызванной разными вирусами, на культивируемых в микрочашках клетках из почки обезьяны [191.
А, Ненифииировзшше контрольные клетки (100Х). Б Вирус ословакцииы и куриные эритроциты (1С0Х) В 13ир\*с шфагриппа, тип I, и эритроциты морской свинки ПСЮХ) Г. Вирус осповлкципы и куриные эритроциты (50Х). Д. Вирус гриппа (Аг/Лпрап ЧРо?) и эритроциты морской свинки (5иХ). Е. Ви-рус парагриппа, тип 3, и эритроциты морской свинки I50XK Все фотографии уменьшены вдвое лрм воспронзводении.
