Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
Основная среда Игла [11] в сбалансированном солевом растворе Эрла [12] . . .
80,0 мл 4,0 мл
Триптозно-фосфатнын бульон
Телячья (или эмбриональная) сыворотка .......
10,0 мл 1,8 мл
NaHC03 (7,5%)
Смесь пенициллина и стрептомицина (200 ед./мл или 200 мкг/мл)1.................
шгч/иш/.................
Неомицин (100 мкг/мл)1 . . Амфотерицин В (5 мкг/мл)1
0,2 мл 0,1 мл 0,05 мл
0,2
0,1
Сбалансированный солевой раствор Эрла
До 100 мл
pH 7,0—7,2
1 Конечные концентрации. — Прим. перев.
Телячья сыворотка необходима для прикрепления и распластывания клеток по поверхности пластика. Ее минимальная концентрация варьирует для разных клеточных линий. Сыворотка должна быть предварительно проверена на присутствие специфических и неспецифических ингибиторов вирусов. (Сыворотку, лишенную ингибиторов, производит Hyland Laboratories, Los Angeles,
Образовавшийся монослой можно сохранить в течение некоторого времени, заменив среду для роста клеток поддерживающей средой. При смене среды сильным и быстрым движением руки стряхивают старую среду, а клетки остор'ожно промывают сбалансированным солевым раствором и добавляют поддерживающую среду.
Для сохранения жизнеспособности клеток в монослое первичных или вторичных культур используют среду 199 [13] или основную среду Игла [11]. Для других клеток пригодна «универсальная» среда (см. выше) с уменьшенным содержанием сыворотки (2—5%). Кроме того, в поддерживающей среде рекомендуется слегка повысить pH до 7,3—7,4. Ряд исследователей [15, 16] в каче-
Calif.)
2. Поддерживающая среда
стве поддерживающей среды для клеток, культивируемых в микрочашках, используют среду L-15 [14]. При культивировании на этой среде возможен свободный обмен газов с атмосферой, так как источником энергии в этой среде служит не глюкоза, а галактоза, в результате чего процессы метаболизма в клетках протекают медленнее и образуется- меньшее количество СОг-
3. Разбавитель
Для разбавления сыворотки или вируса может быть выбрана любая из обычно употребляемых сред. Однако, поскольку она составляет 30—50% общего объема среды для роста клеток, ее состав должен быть совместим с составом последней. Состав стандартного разбавителя (100 мл), используемого нами, следующий:
Гидролизат лактальбумина (0,5%) в сбалансированном солевом растворе Эрла
(ГЛЭ).......................
NaHC03 (7,5%).................
Пенициллин и стрептомицин (200 ед./мл или 200 мкг/мл)1 Неомицин (100 мкг/мл)1 . .
Амфотерицин В (5 мкг/мл)1
ГЛЭ...........................
pH 7,0
1 КонечЕ1ые концентрации. — Прим. перев.
Б. ПОДГОТОВКА КЛЕТОК
Подготовка клеток для культивирования в микрочашках показана на рис. 3.8. Суспензию клеток для посева получают путем трипсинизации органов или из запасной культуры клеток, растущих в сосудах. Клетки диплоидных штаммов диспергируют следами трипсина [18]. Для получения клеточной суспензии используют также версен. В некоторых случаях достаточно сильно встряхнуть сосуд, в котором выращивают клетки. Для посева могут быть использованы также клетки, растущие в суспензии. Взятые в линейной фазе роста, они формируют монослой через 24 ч после имплантации.
95,5 мл 1,0 мл
0,2 мл 0,1 мл 0,05 мл До 100 мл
Концентрация клеток для посева на микрочашки такая же, как и при посеве в пробирки, но необходимый объем среды составляет лишь 'До объема среды в про-
Рис, 3.8. Приготовление клеток для посева в микрочашки.
/ — получение суспензии клеток трипсиннэацней или другими методами; 2 — центрнфугнроваЕ!ие; .? — ресуспенднрование клеток в ростовой среде; 4 — внесение аликвотов в лунки (в каждую лунку по 0,025 мл суспензии).
бирках. Концентрации клеток и среды, рекомендуемые Для разных типов клеток, приведены в табл. 3.1.
Клетки, суспендированные в ростовой среде, добавляются в микрочашки микропипеткой объемом 0,025 мл. При проведении различных тестов клетки добавляют после разведения исследуемого материала. Так как клет-
Условия культивирования клеток в микрочашках
и О '
Е
о.
V
к
si
*
РЗ 2 и ^ с, о
о -* С
о
О
Есч
S ?3
S ^1—1 о t-
W О.СП
<Т)2
Е
О а; то ж о. н
S О 9J
та аз ex дану
О .
_ сг к * * Е
« х ч 3d ^ и & в
Ш
I".
I
ю
я Ой? о я «Jin =
1 S+S«
(-1 * ,«, 2 л)
SSI*|
S'5® "
ИМ
<-> S & и . „ {J t- >ы
Ер о о
2 я Я 9- = 5 q о ° д Й го и 2 ч
=: \0 а; j3 га S о с; о ™
ОС
I
CN
С
а
О ч
и in S 1Л
; tlC
СП
]
сч
5 ^
xga
5
о |
и я 5 5 ч §
? * *
О
*
¦А
О
.С V .
5. “ &
>> э* Ч * О _ С * _ «
< 5 я к ? ° Е S 5 г 5 |
а.*?. л
a> «
с
о
3
a
о
н
о
о
К
