Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
ведений сыворотки в солевом растворе и определении показателя преломления каждого разведения. Существует несколько типов недорогих приборов для определения показателя преломления (например, TS Meter, выпускаемый фирмой American Optical Co., Buffalo, N. Y.). По показаниям прибора строят график в логарифмической шкале; если линия регрессии прямая, то петля отрегулирована правильно, если нет, то с помощью пинцета или другого инструмента нужно поправить отверстие петли. Правильность калибровки необходимо проверять у новых петель и периодически после использования у старых.
В. РАЗВЕДЕНИЕ
Соблюдение определенной последовательности при работе с петлей дает возможность стандартизировать метод. Эта последовательность, предложенная Севером [7] и модифицированная в нашей лаборатории, схематически показана на рис. 3.5. Следует подчеркнуть, что пауза между этапами 4 и 5 может привести к тому, что на петле исчезнет затравка, в результате чего титры окажутся ошибочными. Для наполнения петли достаточно лишь коснуться ею поверхности раствора. При этом необходимо следить, чтобы петля не касалась пузырьков воздуха. При титровании неинфекционного материала этап 7 (деконтаминация) может быть опущен. Одновременная работа с 8 петлями требует тренировки, особенно при последовательном переносе материала в другие углубления (рис. 3.6). Начинающие обычно работают с 4 петлями. По мере приобретения определенных навыков число петель увеличивают до 8 и тогда можно одновременно, титровать все 8 образцов, помещающихся на пластинке 8X12. Каждый, кто работает с петлями, должен тщательно выполнять последовательность действий, показанную на рис. 3.5. Это крайне важно для получения воспроизводимых результатов по определению титра. Петли используются не только для разведения вируса и сыворотки. Они пригодны для разведения клеточной суспензии, определения токсинов, антитоксинов, антивирусных препаратов и других растворов или суспензий.
Рис. 3,5. Использование петли при переносе и разведении исследуемого материала.
/ — штатив для петель; 2 — очистка петли в пламени (после этого петлю следует охладить); 3 — заполнение петли разбавителем для затравки (I мин); 4 — проба на бланке; 5 — заполнение петли исследуемым материалом; € — разбавление исследуемого материала вращением петли; 7 — дезинфекция петли {вирусологические исследования) в 0,5%-ном растворе гипохлорнта натрия (1 мин); 5 —удаление жидкости из петли с помощью куска марли; 9 — ополаскивание петлн в дистиллированной воде; 10 — удаление жидкости из петли; // — очистка в пламени (после этого петлю следует вновь охладить).
г. микроскопы
Результаты различных тестов можно наблюдать с помощью либо макро-, либо микрометодов. Для исследования вирусов, вызывающих патологические измене* ния в клетках или их лизис, необходим микроскоп. Наблюдения за состоянием живых клеток в культивируемых пластиковых пластинках, а также за последова-
тельными изменениями, вызванными действием вирусов, осуществляют в обычном или инвертированном микроскопе. Преимущества инвертированного микроскопа в том, что положение клеток и жидкости можно не менять (рис. 3.7). Это особенно важно в тех случаях, когда отверстия углублений не заклеены. В других случаях, когда пластпнки можно переворачивать без ущерба для содержимого, применяют обычный микроскоп.
Титр вирусов часто определяют колориметрическим способом по подавлению метаболизма в клетках. Рост вируса или подавление клеточного метаболизма оценивают по изменению цвета индикатора pH (нетоксичного для клеток), входящего в состав среды.
Гемагглютинация может быть использована для макроскопического исследования миксовирусов и других агентов, вызывающих этот эффект.
Мы перечислили только основное оборудование, необходимое для культивирования клеток и проведения анализа. Разработана система автоматического титрования (Autotiter, Astec., Inc., Orange, Conn.)., которая может быть очень полезна при проведении серологических исследований в широких масштабах.
Рнс. 3.6, Техника разведения с одновременным использованием восьми петель.
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК
Многие типы клеток, которые растут на стекле, можно культивировать в микрополичашках [9]. К ним относятся первичные или вторичные культуры разных органов, полупостоянные штаммы (например, диплоидные
клетки, полученные из эмбриональных легких человека) или перевиваемые линии клеток злокачественного происхождения. Методика культивирования клеток в микросистеме сходна с макрометодами, но для нее требуются
Рис. 3.7. Инвертированный микроскоп с пластинкой на столике.
меньшие объемы компонентов. Ниже приводится методика культивирования, которую можно видоизменить в зависимости от поставленной задачи.
А. СРЕДЫ
I. Ростовая среда
Для роста клеток в микрополичашках используется такая же среда, как и для роста клеток в стеклянных флаконах. Мы пришли к заключению, что для роста любых клеток трех основных типов пригодна так называемая «универсальная» среда. Состав этой питательной среды (100 мл) приводится ниже:
