Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
ют монослой. Дно лунки может быть либо U-образным, либо плоским. Пластинки и с U-образными лунками пригодны в тех случаях, когда методика культивирования не требует микроскопических исследований при больших увеличениях. При увеличениях более чем в 100 раз желательно использовать пластинки с плоскодонными лунками. Пластинка, показанная на рис. 3.1, имеет размер 8X12 см и содержит 96 U-образных лунок. Объем каждой лунки составляет примерно 0,25 мл. Для пластинок из гибкого, мягкого пластика применяют резиновые подставки.
Очень часто новые пластинки токсичны для клеток. Для снятия токсического эффекта пластинки замачива-
ют на 1—2 ч в 70—90%-ном этиловом или изопропиловом спирте. (Некоторые исследователи предварительно моют их детергентом, но мы не считаем это необходимым.) Нельзя допускать испарения спирта, ибо это фиксирует токсические свойства. После промывки спиртом пластинки переворачивают вверх дном, чтобы стек спирт, а затем промывают сначала в трех сменах водопроводной воды, потом в трех сменах тридистиллиро-ванной воды. Воду тщательно стряхивают, а пластинки высушивают на воздухе и хранят в коробках, в которых их выпускают.
Пластинки не стерилизуют, если в культуральной среде содержатся антибиотики, В тех случаях, когда для проведения опыта требуется абсолютная стерильность, чашки предварительно стерилизуют, либо облучая ультрафиолетом, либо обрабатывая окисью этилена.
Лунки можно закрыть прозрачной клейкой лентой или 1—2 каплями легкого минерального масла (Drakeol, Pennsylvania Refining Co., Butler, Pa.). При культивировании клеток в термостате во влажной атмосфере, насыщенной ССЬ, масло служит защитой от пыли.
2. Микропипетки
Микропипетки, или капельницы, изготовляют из твердого пластика (полипропилена), выдерживающего ав-токлавирование. Каждая пипетка заканчивается иглой, выходное отверстие которой имеет определенный диаметр, так что объем высвобождающейся капли равен
0,025 или 0,05 мл. Такие микропипетки используются для заполнения лунок одинаковым количеством жидкого материала, например растворителем, суспензией клеток, дозой вируса. В качестве меры предосторожности пипетку затыкают ватной пробкой. Некоторые исследователи предпочитают пользоваться дешевыми пастеровскими пипетками с калиброванным входным отверстием, которые можно выбрасывать после употребления. Жидкость насасывают в пипетку, после чего кончик иглы вытирают стерильной тканью для того, чтобы удалить избыток жидкости. Частота капель обычно контролируется давлением пальца; можно так-
же пользоваться резиновым баллончиком (рис. 3.2). Во время работы пипетки следует держать в строго вертикальном положении для получения точного объема капли.
3. Петли
Важным новшеством в методике микротитрования явилось использование петли для переноса и разведения исследуемого материала. Такая петля представляет собой по сути дела модифицированную бактериологическую петлю и применяется для точного переноса определенного объема жидкости. Если петлю опустить и вынуть из жидкости, то внутри кольца благодаря капиллярным силам и силам поверхностного натяжения образуется пленка. Действие этих сил исчезает, когда петлю помещают в ка-кую-либо жидкость, в результате чего пленка высвобождается в эту жидкость и происходит разведение. В основе титрования разведением лежит последовательный перенос петлей определенного объема исследуемого материала в определенный объем жидкости.
Петли могут иметь различную конструкцию. Петля, примененная впервые Такачи, представляла собой проволочную спираль, закругленную в форме шара. Позднее была сконструирована петля в форме тюльпана (рис. 3.3). Такая петля гораздо удобнее, чем спираль, поскольку она меньше повреждается при работе. С помощью петли каждого из этих типов можно переносить объем, составляющий 0,025 мл (имеются петли, переносящие 0,05 мл). Изготавливают петли из нержавеющей стали, очищают и стерилизуют в пламени горелки.
Рис. 3.2. Заполнение лунок микропипеткой.
Сухие петли адсорбируют меньшее количество жидкости. Для точного переноса исследуемого материала перед употреблением петлю опускают в стерильный физиологический раствор или другой растворитель. Для того чтобы определить, правильно ли заполнилась петля, пользуются специальным бланком фильтровальной бу-
Рис. 3.3. Петля в виде Рис. 3.4. Бланк для проверки петли, тюльпана .из нержавеющей стали (уве-лнч. в 5 раз).
маги (блоттером) с напечатанными на них окружностями (рис. 3.4). Петлей, смоченной в физиологическом растворе, касаются центра окружности на бумаге. Жидкость впитывается бумагой, и внутри в пределах окружности образуется темное пятно (рис. 3.4). Оставшаяся пленка служит затравкой при заполнении петли исследуемой жидкостью. Эта процедура, однако, не позволяет решить, правильно ли откалибрована петля.
Б. КАЛИБРОВКА ПЕТЛИ
Простой метод калибровки и регулировки петель по показателю преломления предложен Эдвардсом и др. [10]. Калибровка осуществляется приготовлением раз-
