Новые методы культуры животных тканей - Фридлянской И.И.
Скачать (прямая ссылка):
вируса) происходит «сползание» эритроцитов (обычно через 10—30 мин). В культурах, в коюрых большая часть вируса не. адсорбировалась, также обнаруживается «сползание» эритроцитов, что указывает на торможение размножения вируса. В культурах, в которых
Е- ттрабаниеi
т i; ,
fee 1 *
ШШр&Ш
мштт
*• '' *rw, Ч-, -r^ , чч I 'V'MtMm
Шортжент гегШсорбщш.
.Jkfioem 0**г,^Штр/ша&сртае AJfitm, Aj&ijW %/*>ш№
Рис. 3.18. Макроскопическая оценка титрования реакции гемадсорбции вирусов гриппа Аг/НК/68 и В/Mass/бб (левая пластинка) и ти-гшрование А2/НК768 с помощью гипериммунной куриной сыворотки
(правая пластинка).
Лунки с «пуговками» эритроцитов указывают на отсутствие гемадсорбции. Торможение его типоспецифической иммунной сывороткой показано на правой
пластинке.
нейтрализация вируса не происходит, эритроциты адсорбируются клеточным монослоем (рис. 3.18). Для обнаружения вирусов можно проводить и более чувствительное микроскопическое исследование, однако как оценка, так и подготовка материала для микроскопии более трудоемки.
Д. СПЕЦИАЛЬНЫЕ ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
Для клеток, культивируемых на пластинках, применимы почти все обычные методы окрашивания при условии, что фиксатор не растворяет пластик, как, например, ацетон. Прекрасные результаты получают при использовании спирта, формалина, четырехокиси осмия, а также жидкостей Карнуа и Буэна. Окрашивать клетки можно метиленовым синим, метиловым фиолетовым.
гематоксилином и эозином, растворами Гимза, Райта и Май-Грюнвальд, а также реактивом Фельгена (рис. 3.14).
Фиксацию, окрашивание и отмывку проводят прямо на пластинках, что дает возможность сэкономить посуду и свести к минимуму потери реактивов. В процессе окрашивания клетки обычно обезвоживаются. Для того чтобы они восстановили нормальную форму, к ним добавляют каплю масла. Окрашенные клетки можно исследовать с помощью простого микроскопа, положив пластинку на столик микроскопа вверх дном. В тех случаях, когда исследование ведут при больших увеличениях, иммерсионное масло капают на наружную поверхность пластинки.
Внутриклеточную структуру исследуют с помощью сухих или иммерсионных объективов. Для работы при больших увеличениях рекомендуется использовать пластинки с лунками, имеющими плоское дно, поскольку это уменьшает периферические искажения.
Е. ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ АНТИТЕЛА
Микроскопическую технику с успехом применяют для работы с флуоресцирующими антителами (рис. 3.19) и неконъюгирующими флуоресцирующими красителями, например с акридиновым оранжевым и корифосфи-ном-О.
При работе с темнопольным конденсором между конденсором и исследуемым материалом должно находиться масло, поэтому часто целые пластинки использовать нельзя. В‘таких случаях пробойником для пробок, диаметр которого несколько меньше диаметра углубления, можно вырезать дно пластинки (пластинка из мягкого пластика) с окрашенными клетками. Чтобы получить ровные диски, следует предварительно осторожно нагреть пластинку. Диск помещают на предметное стекло как покровное. Для исследования тонкой структуры клетки, когда работают при больших увеличениях микроскопа, толщина пластинок должна быть меньше 1 мм.
Рис. 3.19. Нормальные (А) и инфицированные (Б) культуры клеток почки обезьяны, окрашенные флуоресцирующими антителами, специфичными в отношении вируса гриппа A2/HongKong/1968 (266 X).
Ж. ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ
Розенбаум и др. [34] разработали метод, который позволяет применять клеточные культуры, выращиваемые в микрочашках для электронноскопических исследований. Мы не будем подробно останавливаться на вы-
Рис. 3.20. Подготовка клеток, культивируемых в микрочашках для
заливки и последующей резки на ультратоме [341.
1 — посев и инкубация клеток в течение 72 ч при 36 °С; 2 — образование монослоя; 3 — фиксация и обезвоживание; 4 — заливка и инкубация в течение 48 ч при 60 °С; 5 — заточка блока; 6 — установка на столике и резка.
боре фиксатора, приготовлении сред для заливки, степени их твердости и т. д. Все это зависит от целей эксперимента и привычки экспериментатора. Укажем лишь, насколько применение микрочашек облегчает такие процедуры (рис. 3.20).
Как правило, получение клеточного монослоя для
приготовления ультратонких срезов является чрезвычайно кропотливым процессом. Клетки обычно выращивают в пробирках на покровных стеклах, затем перед фиксацией, обезвоживанием и заливкой снимают с поверхности покровного стекла и переносят в пластиковую
Рис. 3.21. Так выглядят микрочашки с культурой клеток, залитые полиакриламидной смолой, 'которая полимеризовалась с образованием твердого блоха для получения ультратонких срезов [34].
капсулу. Весь этот процесс, вплоть до подготовки блока к резке, можно выполнить в лунках, если клетки выращивают в микрочашках (рис. 3.21). Такой метод позволяет исключить многие предварительные этапы и, кроме того, дает большое число образцов. Приведем краткое описание метода. После того, как клетки образуют монослой, из лунок сливают среду и клетки промывают несколько раз 0,01 М солевым фосфатным буфером (pH 7,0). Фиксацию проводят под хорошо вентилируемым колпаком. Пластинку переворачивают вверх дном и кладут на крышку, на которую помещают фильтровальную бумагу, насыщенную 2%-ной четырехокисью осмия. Пластинку с клетками держат в парах фиксато-
